Ричард Александър Шелтема

От ‡ Департамент по протеомика и трансдукция на сигнали, Институт по биохимия на Макс Планк, Am Klopferspitz 18, D-82152 Martinsried, Германия;

филтър

Ян-Питър Хаушилд

§Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Strasse 11, 28199 Бремен, Германия

Оливър Ланг

§Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Strasse 11, 28199 Бремен, Германия

Даниел Хорнбург

От ‡ Департамент по протеомика и трансдукция на сигнали, Институт по биохимия на Макс Планк, Am Klopferspitz 18, D-82152 Martinsried, Германия;

Едуард Денисов

§Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Strasse 11, 28199 Бремен, Германия

Ойген Дамок

§Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Strasse 11, 28199 Бремен, Германия

Андреас Кюн

§Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Strasse 11, 28199 Бремен, Германия

Александър Макаров

§Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Strasse 11, 28199 Бремен, Германия

Матиас Ман

От ‡ Катедра по протеомика и сигнална трансдукция, Институт по биохимия „Макс Планк“, Am Klopferspitz 18, D-82152 Martinsried, Германия;

Свързани данни

Резюме

Наномащабната течна хроматография, свързана онлайн с масспектрометрия, е настоящата избрана техника за анализ на сложни пептидни смеси. В стратегия за топ N-пушка пълното сканиране, осигуряващо пълен преглед на изотопните модели, получени от йонизирани пептиди, е последвано от N фрагментационни сканирания, извършени върху най-разпространените все още несекуирани изотопни модели, видими в момента при пълното сканиране. По време на фрагментацията целта е да се изолира чисто предвиденият прекурсорен пептиден йон, което днес обикновено се извършва или от линеен йонен капан, или от квадруполен масов филтър. След това фрагментните йони се измерват с маса с анализатор на масата Orbitrap, анализатор на времето на полет или по-рядко с резонанс на йонния циклотрон-Фурие или линейни или триизмерни йонни капани.

Освен инструментариума на MS, последните разработки в работния процес на протеомиката включват преминаване към автоматизирани онлайн системи за контрол на качеството (7, 8) и еднократни анализи (9), които изискват пептидна хроматография с много висока производителност (10, 11).

Тук описваме напредъка, включен в Q Exactive Plus и Q Exactive HF инструментите. Те включват подобрена устойчивост, постигната от филтър с ниска разделителна способност пред квадрупола, сегментиран квадрупол и, в случая с Q Exactive HF инструмент, анализатор на масивна орбитрап с ултра-високо поле, удвояваща резолюция или скорост на придобиване. Ние описваме тези възможности в контекста на еднократния анализ на сложна смес на пептиди и фосфопептиди.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ПРОЦЕДУРИ

Изграждане на Q Exactive Plus

Подробности за конструкцията на Q Exactive HF. Този инструмент е базиран на серията Q Exactive и го подобрява с предварителен филтър за маса, реализиран в инжекционния флатапол (A), активно насочващ огънат флапопол (B) и сегментиран квадрупол (C). Тази комбинация предотвратява навлизането на замърсяване в уреда и подобрява почти двукратно предаването на йони. Анализаторът за ултра-високо поле Orbitrap (D) не е задължителен.

Обхватът на покритата маса в анализатора Orbitrap е m/z 50–6000. Изборът на маса на предшественика от квадрупола е възможен до m/z 2500, а изолационните прозорци могат да бъдат настроени между 0,4 и 5600 Th. Софтуерът на инструмента автоматично регулира необходимото време за инжектиране на йони, за да компенсира загубата на предаване при намаляване на изолационната ширина. Скоростта на придобиване с класическия анализатор Orbitrap остава същата, както е съобщено по-рано, докато за високополевия Orbitrap тя варира от 27 Hz за разрешаваща мощност 15 000, определена при m/z 200 (съответстваща на 10 000 при m/z 400) до 1,5 Hz за разделителна мощност 240 000 при m/z 200 (съответстваща на 170 000 при m/z 400). Вакуумът в отделението за Orbitrap може да бъде регулиран по електронен път 5 пъти, което позволява анализ с висока разделителна способност на повечето аналити, включително големи пептиди и малки протеини.

Подготовка на HeLa Lysates
Обогатяване с фосфорилиране на нестимулирани HeLa клетки
LC-MS/MS анализ

Онлайн хроматографията беше извършена с HPLC система с високо налягане Thermo Easy nLC (Thermo Fisher Scientific), свързана онлайн към оригинален Q Exactive или Q Exactive HF с източник NanoFlex (Thermo Fisher Scientific). Аналитичните колони (с дължина 50 cm, вътрешен диаметър 75 μm) са опаковани вътре в ReproSil-Pur C18 AQ 1,9 µm смола с обърната фаза (Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch-Entringen, Германия) в буфер А (0,5% оцетна киселина ). По време на онлайн анализ аналитичната колона беше поставена в нагревател на колона (Sonation GmbH, Biberach, Германия), регулирана до температура от 55 ° C. Пептидна смес от 2 μg сухо тегло се зарежда върху аналитичната колона с буфер А при максимално обратно налягане от 980 бара (обикновено води до скорост на потока 450 nL/min) и се разделя с линеен градиент от 5% до 30 % буфер В (80% ACN и 0,5% оцетна киселина) при скорост на потока 250 nL/min, контролирана от технологията IntelliFlow за 90 минути (обикновено при обратно налягане от около 500 бара). Поради стъпките на зареждане, въвеждане и измиване, общото време за LC-MS/MS бягане беше с около 40 до 50 минути по-дълго. Онлайн контрол на качеството, включително автоматично откриване на образуването на големи капчици, HPLC параметри и състоянието на компютъра, свързано с придобиването, беше извършен със SprayQc (8).

Филтър за избор на маса на характеристиките на трансмисията. A, сравнение на ефективността на изолационния прозорец между Q Exactive и Q Exactive Plus, използвайки пълния набор от калмикс йони. В, сравнение на ефективността на предаване на изолацията между Q Exactive и Q Exactive HF, използвайки пълния набор от калмикс йони. С, общо уникални пептиди от сложен HeLa общ клетъчен лизат, секвенирани с набор от изолационни прозорци. Вторичната у-ос означава приноса на опцията Andromeda „втори пептид“ като процент (SecPep). D, изолационна чистота от сложен HeLa общ клетъчен лизат, секвениран с набор от изолационни прозорци.

При сравнението между Q Exactive и Q Exactive HF забелязахме, че е налице 1,5-кратно надценяване на броя на йони, предлагани за фрагментация на Q Exactive HF спрямо Q Exactive пробезите. За да определим дали това е имало допълнителен ефект върху производителността на инструмента, ние изследвахме ефективността на различни целеви стойности. От това установихме, че първоначалната стойност на Q Exactive от 1e5 йони остава оптимална за Q Exactive Plus и Q Exactive HF (допълнителна фиг. S6).

Анализ на данни

РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ

Йонният път по време на квадруполната изолация на Q Exactive HF (както и Plus) е актуализиран с цел подобряване на устойчивостта и оптимизиране на предаването на йони по време на квадруполна изолация, за да може да отговори на търсенето, създадено от увеличената скорост на анализаторът за маса на свръхвисоко поле Orbitrap. Различните хардуерни компоненти, съставляващи пътя, са подробно описани в „Експериментални процедури“. Започваме дискусията си, като изследваме тяхното поведение, използвайки стандартния ESI позитивен разтвор за калибриране на йони (Thermo Fisher Scientific), електроразпръскван чрез директна инфузия. След това характеризираме ефективността на инструмента въз основа на резултати от HeLa лизати от цели клетки, измерени чрез пушка топ-N методи.

Инжекционен флатопол като предфилтър

Подробности за експлоатацията на филтъра за предмасово инжектиране на флатапол. А, калмиксният спектър при изолиране на MRFA (524,27 m/z) в изолационен прозорец от 80 Th. Вмъкването увеличава изолационния прозорец и неговата пряка обстановка. Б, ефективност на изолиране на филтъра за предварително натрупване на маса през редица изолационни прозорци. C, ефективност на филтъра за предварително масова маса за редица изолационни прозорци върху цял клетъчен лизат на HeLa. D, снимка на инжекционния флатапол след 3 месеца непрекъснати измервания.

Сегментиран квадрупол

Оригиналният квадрупол с хиперболични пръти е заменен от сегментирана версия, способна да постигне по-голяма правоъгълна ефективност на изолация през целия изолационен прозорец (фиг. 3 А). Това е от значение за стратегии за придобиване като SWATH (23) и коизолация на партньори на SILAC (например в избрани сканирания за мониторинг на йони), които изискват правоъгълни изолационни прозорци, за да генерират точна количествена информация по техните краища. По отношение на квадрупола в Q Exactive, ние наблюдавахме значително подобрена ефективност на изолация в страната с ниска маса на изолационния прозорец. Освен това е подобрено предаването на квадрупола за тесни изолационни прозорци. Измерихме тази подобрена ефективност за набора от калмикс йони и установихме почти 2-кратно увеличение (фиг. 2 Б). Обърнете внимание, че фигурата показва и предимство на предаване за по-големи изолационни прозорци, особено за йони с висок m/z, което се дължи на фокусиращия ефект на изходния сегмент на квадрупола. Това подобрение приблизително съответства на нарастването на йонния ток, необходимо за поддържане на удвояването на скоростта на сканиране, на което е способен анализаторът на високо поле Orbitrap (тъй като времето за пълнене съответства на преходното време при напълно паралелна работа на инструмента).

Ефективност на анализатора на ултра-високо поле

Ефективност на Q Exactive HF с анализатор с ултра-високо поле Orbitrap. А, сравнение на размерите на стандарта (вляво) с компактния, ултра-високополевия анализатор Orbitrap (вдясно). Б, сравнение на необходимите преходни времена на Orbitrap, необходими за различните разделителни способности, заедно с оценка на времето, необходимо за всяко сканиране. С, измерена разделителна способност на пикове, открити от комплексния HeLa общ клетъчен лизат. D, сканирайте сравнение на статистическите данни между Q Exactive и Q Exactive Plus за HeLa общ клетъчен лизат.

Оптимална проверка на стойността на параметъра

След индивидуална оптимизация на параметрите за Q Exactive HF, извършихме независима проверка на оптималните стойности за всеки от параметрите, използвайки подход на проектиране на експеримента (29, 30), използвайки MODDE (Umetrics, Франкфурт, Германия). Предимството на такъв подход е, че той дава представа за параметрите, които имат потенциално взаимодействащи свойства. За анализ избрахме параметрите, които преди това дадоха най-голям ефект в нашите експерименти, състоящи се от нормализирана енергия на сблъсък (20–40), ниво на честота на S-лещата (40–80) и изолационен прозорец (0,4–3 Th). Обхватът на параметрите е избран да бъде голям и да се центрира върху предварително намерените оптимални стойности. Всички RAW данни са записани въз основа на експерименталния дизайн, установен от софтуера. От резултатите от това проучване стигнахме до заключението, че описаните по-рано стойности са оптимални и че в нашия набор не присъстват значително взаимодействащи параметри, от които да се постигне полза от производителността. Тъй като заключението остава същото и подходът на проектиране на експеримента може да се справи с оскъдни данни, това може да бъде привлекателен тип изследване за бърза оптимизация на LC-MS/MS показатели за различни видове проби и хроматографско разделяне (допълнителна фигура S10).

Q Ефективно представяне за анализ на общия клетъчен лизат

Ефективност на Q Exactive HF с анализатор с ултра-високо поле Orbitrap. A, сравнение по време на цикъла за Q Exactive и Q Exactive HF върху сложен HeLa общ клетъчен лизат. В, секвениране на връх-дълбочина на сравнение между Q Exactive и Q Exactive HF. С, сравнение на общия брой видими пептиди (кумулативно зелено, червено и сиво), секвенирани пептиди (кумулативно зелено и червено) и успешно идентифицирани пептиди (зелено) между Q Exactive и Q Exactive HF. D, кумулативно идентифицирани протеини при градиентното сравнение между Q Exactive и Q Exactive HF. Пунктираните линии означават линейно прилягане в най-стръмната част на кривата.

Една забележителна черта на графиката на цикъла е, че Q Exactive достигна пълната горна N рано в градиента, докато Q Exactive HF постигна пълната горна N много по-късно в градиента. Ние интерпретираме това, че дори в много сложни проби като HeLa пълноклетъчни лизати, началната част на градиента не съдържа достатъчно прекурсорни йони, които отговарят на критериите за избор за фрагментация при тези много високи скорости на секвениране.

По-нататъшни изследвания на динамичния диапазон на идентифицираните пептиди разкриват, че и двата инструмента са надеждно секвенирани над 3 порядъка, което показва, че повишаването на производителността на Q Exactive HF може да се отдаде на способността му да секвенира повече пептиди в натоварените региони на хроматографията. Тази допълнителна скорост е отговорна и за по-висока възпроизводимост при повторно възпроизвеждане на нивото на идентификация на пептида, където инструментът постига по-добра възпроизводимост за по-ниски пептидни количества (допълнителна фигура S8). За да изследваме ефективността на Q Exactive HF при различни дължини на градиента и да предоставим индикация за оптимална производителност на инструмента, ние допълнително проведохме серия от титриране на градиент на стандартните проби HeLa, което разкри, че градиентите в продължение на 4 часа не подобряват допълнително идентификационните характеристики за нашата проба. Въз основа на увеличението за единица време, заключихме, че градиент от 150 минути представлява оптималната дължина. Тенденцията в нашите и други лаборатории за измерване на градиенти над 4 часа или по-дълго вече може до известна степен да бъде обърната (допълнителна фигура S9).

Оптимизирано изпълнение на хроматографията. А, кумулативни протеини над градиента. B, копирайте номера на клетка за откритите протеини.

Приложение към фосфопротеомиката

Обогатени с фосфорилиране проби. A, примерни фрагментни спектри на същия фосфорилиран пептид, идентифициран на Q Exactive (отгоре) и на Q Exactive HF (отдолу). И в двата случая е достигнато максимално разрешеното време за инжектиране на йони. B, сравнение на постигнатата пикова дълбочина на Q Exactive и Q Exactive HF. С, сравнение на успешно секвенираните места за фосфорилиране от клас I.

Заключения и Outlook

Тук ние описахме следващата итерация на семейството на мас спектрометрите Exactive, Q Exactive Plus и Q Exactive HF, и изследвахме неговата ефективност на аналитични стандарти и на сложни пептидни смеси за протеотика на пушки, използвайки нашия стандартен 90-минутен градиент. Анализаторът на свръхвисоко поле Orbitrap удвоява скоростта на секвениране при същата разделителна способност, за която подобрените характеристики на пропускане на йони на сегментирания квадрупол поне частично осигуряват необходимото увеличение на изобилието на прекурсорни йони. По-високата скорост се отразява добре на действителните подобрения на протеомиката на пушката, тъй като наблюдаваме увеличения с повече от 40% в уникални пептидни последователности и повече от 20% в протеини в сравнение с предишното поколение в нашия стандартен градиент с HeLa клетъчен лизат.

В заключение, това ново поколение квадруполни орбитрапни инструменти е проектирано за значително по-голяма здравина и нашите експерименти потвърдиха, че по-голямата част от нежеланите йони са ограничени в предната част на инструмента. По същия начин наблюдавахме значително подобрени характеристики на селекция на новия сегментиран квадрупол, което би трябвало да бъде полезно в много протеомични експерименти. И накрая, и най-важното, анализаторът на ултра-високо поле Orbitrap в Q Exactive HF рутинно осигурява двойна разделителна способност при сканиране на MS без недостатъци и удвоява потенциалната скорост на секвениране в режим MS/MS.

Допълнителен материал

Благодарности

Благодарим на колегите си от Thermo Fisher Scientific, особено на Андреас Вигхаус, Маркус Келман, Стеван Хорнинг, Матиас Мюлер, Амелия Петерсън, Ерик Кузийн и Айварас Венкус, както и от института Макс Планк, особено Корбинян Майр, Феликс Майснер, Ян Рикман, Херберт Шилер и Марко Хайн, за помощ и ползотворни дискусии. Също така благодарим на Стивън Девиц, Игор Парон и Габриеле Сова за техническата помощ.

Декларираме конкурентни финансови интереси.

Базираните на MS данни за протеомика са депозирани в консорциума ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) чрез хранилището на партньора PRIDE с идентификатора на набора от данни PXD001203. За достъп до данните, моля, посетете http://tinyurl.com/nyj5hx9.

Бележки под линия

Принос на автора: R.A.S. и М.М. проектирани изследвания; R.A.S., J.H., O.L., E. Denisov, E. Damoc, A.K. и A.M. извършени изследвания; R.A.S., J.H., O.L., D.H., Е. Денисов, Е. Дамок, А. К. и А.М. допринесе нови реактиви или аналитични инструменти; R.A.S., J.H., O.L., D.H., Е. Денисов, Е. Дамок, А. К., А. М. и М.М. анализирани данни; R.A.S. и М.М. написа вестника.

* Изследванията, водещи до тези резултати, са финансирани от Седмата рамкова програма на Европейската комисия (Споразумение за безвъзмездна помощ ЗДРАВЕ-F4-2008-201648/ПРОСПЕКТИ).

Тази статия съдържа допълнителни материали.