Асоциативна лаборатория за нарушения на липидния метаболизъм и молекулярното хранене, Мадридски институт за напреднали изследвания (IMDEA) -Храна, CEI UAM + CSIC, Мадрид, Испания

диетични

Афилиация Институт по нутризан Джосуе де Кастро, Федерален университет до Рио де Жанейро, Рио де Жанейро, Бразилия

Афилиация Институт по нутризан Джосуе де Кастро, Федерален университет до Рио де Жанейро, Рио де Жанейро, Бразилия

Асоциативна лаборатория за нарушения на липидния метаболизъм и молекулярното хранене, Мадридски институт за напреднали изследвания (IMDEA) -Храна, CEI UAM + CSIC, Мадрид, Испания

Катедра по биохимия и химия, Фармацевтичен и медицински факултет, Университет Сан Пабло CEU, Мадрид, Испания

Асоциативна лаборатория за нарушения на липидния метаболизъм и молекулярното хранене, Мадридски институт за напреднали изследвания (IMDEA) -Храна, CEI UAM + CSIC, Мадрид, Испания

  • Патриша Касас-Агустенч,
  • Флавия С. Фернандес,
  • Мария Г. Таварес до Кармо,
  • Франческо Висиоли,
  • Емилио Ерера,
  • Алберто Давалос

Фигури

Резюме

Цитат: Casas-Agustench P, Fernandes FS, Tavares do Carmo MG, Visioli F, Herrera E, Dávalos A (2015) Консумацията на различни диетични липиди по време на ранна бременност диференциално модулира експресията на микроРНК при майки и потомци. PLoS ONE 10 (2): e0117858. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0117858

Академичен редактор: Кристофър Торенс, Университет в Саутхемптън, ОБЕДИНЕНОТО КРАЛСТВО

Получено: 20 август 2014 г .; Прието: 3 януари 2015 г .; Публикувано: 11 февруари 2015 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Тази работа бе подкрепена отчасти от Института на Салуд Карлос III (FIS, PI11/00315), Европейските фондове на FEDER и Sociedad Española de Arteriosclerosis to A.D .; от Ministerio de Economía y Competitividad на F. V. (AGL2011-28995); от Седмата рамкова програма на Европейския съюз (споразумение за безвъзмездна помощ № PIOF-GA-2010-272581) на P.C-A. и от Fundación Ramón Areces до E.H (CIVP16A1835). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Човешки епидемиологични проучвания, както и различни животински, разкриват, че пренаталните и ранните постнатални хранителни състояния могат да повлияят на податливостта на възрастните към нарушен глюкозен толеранс, сърдечно-съдови заболявания и затлъстяване [1–4]. Въпреки това, малко се знае за механизма (механизмите), лежащ в основата на тези явления [4]. Въпреки че все повече доказателства сочат, че състоянието на мастните киселини при майката по време на бременност и кърмене оказва значително влияние върху здравето на новороденото и бебето [5,6], много малко проучвания са обърнали внимание на дългосрочните последици от промяната в състава на мастните диетични мастни киселини [5,7, 8]. Различните хранителни мастни киселини модулират различни биологично значими пътища [9,10]. Като пример, скорошно проучване при плъхове демонстрира, че приемът на големи количества n-3 мастни киселини в сравнение с други видове мастни киселини по време на ранна бременност намалява натрупването на мазнини и свързания с възрастта спад на инсулиновата чувствителност при мъжкото потомство [5]. Точният характер на тези ефекти обаче остава неуловим.

В допълнение към диетата, епигенетичните модификации могат да повлияят на генната експресия и да модулират фенотипа на организма много по-късно в живота, чрез излагане на променена вътрематочна среда или метаболитни смущения [11–13]. МикроРНК (miRNAs) са малки ендогенни некодиращи РНК, които регулират няколко клетъчни и биологични процеси чрез регулиране на генната експресия [14]. Като се насочват към сложен биологичен път, miRNAs ‘фино настройват’ генната експресия при физиологични условия, но това е в условия на стрес, когато тяхната функция става особено изразена, подчертавайки ролята им за здравето и заболяванията [15].

Настоящото проучване е предназначено да изследва дали консумацията на различни видове мастни киселини през първите 12 дни от бременността при плъхове влияе върху експресията на miRNAs в родителските тъкани и дали тези преждевременни експозиции влияят върху експресията на miRNAs при потомството. В зависимост от оценяваната тъкан се установи, че различни родителски miRNAs са модулирани от различен тип мастни киселини. Дори след 12 месеца след преминаване към нормална чау диета, потомството на възрастния черен дроб показва влияние на експресията на miRNA от ранната експозиция.

Материали и методи

Животни, диети и експериментален дизайн

Обработка на проби

Определяне на състава на мастните киселини. Нонадекаеновата киселина (19: 1; Sigma Chemical Co., Сейнт Луис, Мисури, САЩ) беше добавена като вътрешен стандарт към пресни аликвотни части от всяка диета и замразени черен дроб и лумбални (ретроперитонеални) мастни тъкани бяха използвани за липидна екстракция и пречистване [ 24]. Крайният липиден екстракт се изпарява до сухо под вакуум и остатъкът се суспендира в метанол/толуен (4: 1 по обем) и се подлага на метанолиза в присъствието на ацетил хлорид при 80 ° С в продължение на 2,5 часа, както беше описано по-горе [25]. Метиловите естери на мастни киселини се отделят и определят количествено в газов хроматограф на Perkin-Elmer (Autosystem) с детектор за пламъчна йонизация и 30 m BPX капилярна колона (вътрешен диаметър 0,25 mm). Азотът беше използван като газ-носител и метиловите естери на мастните киселини бяха идентифицирани чрез сравнение с автентични стандарти (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Коефициентът на вариационни стойности, изразени като проценти, варира между 0,0 и 6,0, което дава средна стойност ± ES от 2,28 ± 0,26% за произволен набор от анализи на мастни киселини.

анализ на miRNA

Общата РНК, включително miRNAs, беше извлечена с помощта на miRNeasy minikit (Qiagen, Валенсия, Калифорния, САЩ), следвайки инструкциите на производителя. Цели тъкани се хомогенизират преди екстракцията на РНК. РНК се определя количествено с NanoDrop ND-2000 UV-Vis спектрометър (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA). За miRNA анализи на цял геном на плъхове се синтезира комплементарна ДНК (cDNA), използвайки Universal cDNA синтез комплект II (Exiqon, Vedbaek, Дания). miRNAs бяха анализирани чрез qPCR в реално време (qRT-PCR), използвайки готови за използване PCR панели miRNome miRNA от плъх и зелена главна смес ExiLENT Sybr (Exiqon, Vedbaek, Дания), следвайки инструкциите на производителя. Анализът на miRNome беше оценен в 4 проби на група. За индивидуален анализ на miRNA, cDNA е синтезирана с помощта на комплект за обратна транскрипция miScript® II (Qiagen, Germantown, MD) съгласно указанията на производителя. Отделни miRNAs бяха количествено определени чрез qRT-PCR, използвайки ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Life Technologies, USA). RNU43, RNU6 и/или RNU5G бяха използвани като домакински гени и анализът на относителната генна експресия беше анализиран с помощта на метода 2 (-Delta Delta C (T)) [26] и с помощта на Exiqon GenEx qPCR софтуер за анализ (Exiqon, Vedbaek, Дания).

Анализ на генната експресия

Експресията (mRNA) на гени, свързани с сигнализиране за инсулин, бяха анализирани чрез qRT-PCR, като се използва PCR масив от сигнален път за инсулин на плъх (SABiosiences-Qiagen, Hilden, Германия), следвайки инструкциите на производителя. Анализирани са 5 животни на група. Актинът се използва като домакински ген и се анализира относителната генна експресия, както е описано по-горе.

Статистически анализ

Всички данни са изразени като средни стойности ± SE. Данните бяха тествани за нормално разпределение с теста на Колмогоров-Смирнов и статистическите разлики между диетичните групи бяха измерени чрез еднопосочен ANOVA с Newman-Keuls pos hoc или Kruskal-Wallis, последвано от корекция на Dunnet за множество сравнения. Разликите между две променливи бяха измерени с t- или тестове на Ман-Уитни, според нормалността на разпределението на данните. Използвахме статистическия софтуер SPSS v.17. GenEX v.2.6.4. за управление на данните qRT-PCR и софтуера GraphPad Prism 5.01 (GraphPad Software Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ) е използван софтуер (MultiD Analyses AB, Göteborg, Швеция).

Резултати

Хранителни параметри, тегло на тялото и тъканите

Експресия на miRNA в черен дроб и мастна тъкан при бременни и девствени плъхове

Данните се изразяват като кратна промяна (средна стойност ± SD) спрямо групата на SO диетата. SO диета, 1; ОО диета, 2; FO диета, 3; LO диета, 4; PO диета, 5. Различни букви в една и съща графика означават статистическа разлика (P Фигура 2. Нива на експресия на микроРНК при бременни (A) и девствени (B) плъхове в лумбалната мастна тъкан според диетичното лечение в продължение на 12 дни.

Данните се изразяват като кратна промяна (средна стойност ± SD) спрямо групата на SO диетата. SO диета, 1; ОО диета, 2; FO диета, 3; LO диета, 4; PO диета, 5. Различни букви в една и съща графика означават статистическа разлика (P Фигура 3. Нива на експресия на микроРНК в черния дроб на 1 ден (A) и възрастни малки (B) според диетичното лечение на майка им през първите 12 дни от бременност.

Данните се изразяват като кратна промяна (средна стойност ± SD) спрямо групата на SO диетата. SO диета, 1; ОО диета, 2; FO диета, 3; LO диета, 4; PO диета, 5. Различните букви в една и съща графика означават статистическа разлика (P Фиг. 4. Нива на експресия на избрани гени, свързани с инсулиновата сигнализация в черния дроб на възрастни малки, според диетичното лечение на майка им през първите 12 дни от бременността.