Брайън Фарнети

1 Изследователски и иновационен център, Fondazione Edmund Mach, чрез Mach 1, 38010 San Michele all’Adige, Trento, Италия

Марио Ди Гуардо

1 Изследователски и иновационен център, Fondazione Edmund Mach, през Mach 1, 38010 San Michele all’Adige, Trento, Италия

2 Експериментални растителни науки за висше училище, Университет Вагенинген, пощенска кутия 386, 6700 AJ Вагенинген, Холандия

Юлия Хоменко

1 Изследователски и иновационен център, Fondazione Edmund Mach, през Mach 1, 38010 San Michele all’Adige, Trento, Италия

3 Институт за йонна физика и приложна физика, Университет в Инсбрук, Technikerstr. 25/3, 6020 Инсбрук, Австрия

Лука Капелин

1 Изследователски и иновационен център, Fondazione Edmund Mach, през Mach 1, 38010 San Michele all’Adige, Trento, Италия

Франко Биазиоли

1 Изследователски и иновационен център, Fondazione Edmund Mach, чрез Mach 1, 38010 San Michele all’Adige, Trento, Италия

Рикардо Веласко

1 Изследователски и иновационен център, Fondazione Edmund Mach, през Mach 1, 38010 San Michele all’Adige, Trento, Италия

Фабрицио Коста

1 Изследователски и иновационен център, Fondazione Edmund Mach, през Mach 1, 38010 San Michele all’Adige, Trento, Италия

Свързани данни

Резюме

Въведение

Плодовете са важни компоненти на човешката диета, като доставят важни елементи като захари, органични киселини, витамини и фибри. Тези елементи се променят по време на процеса на развитие на плодовете, за да направят плодовете по-привлекателни и вкусни, особено в началото на узряването. Като цяло, масивът от тези съединения определя качеството на плода като степен на върхови постижения (Klee, 2010). Следователно качеството на плодовете може да се определи от четири основни качествени фактора: външен вид, вкус, текстура и хранителни свойства (Costa et al., 2011). Сред тях външният вид, текстурата и вкусът пряко влияят на ефективността след прибиране на реколтата и оценката на потребителите (Harker et al., 2008; Cliff et al., 2016) и следователно на пазарната продаваемост на плодовете.

Физиологично, структурата на плодовете зависи от процеса на демонтиране, протичащ в архитектурата на полизахаридната клетъчна стена, координирана от протеини, модифициращи клетъчната стена. Структурата на плодовете се състои от поредица от субстратни компоненти, класифицирани по механични и акустични свойства (Varela et al., 2006; Costa et al., 2011, 2012). Освен предпочитанията на потребителите за хрупкави и сочни ябълки, по-твърдите плодове са по-податливи на дългосрочно съхранение, улеснявайки корабоплаването и осигурявайки навременна наличност на пазара на плодове. В допълнение, плодовият вкус също е друг важен качествен фактор, който е резултат от комбинацията от голям набор от първични и вторични метаболити. Докато вкусът е свързан предимно с нелетливи метаболити (главно захари, органични киселини, свободни аминокиселини и соли), ароматът е представен от взаимодействието на смес от летливи органични съединения (ЛОС) с човешки рецептори. Ароматът на ябълката зависи от взаимодействието на> 370 ЛОС (Dimick и Hoskin, 1983; Fuhrmann и Grosch, 2002; Ulrich и Dunemann, 2012; Farneti et al., 2015a), синтезирани от плодовете по време на узряването и засилени при клетъчно разрушаване чрез ухапване и дъвчене (Contreras and Beaudry, 2013; Farneti et al., 2015b). Сред тях могат да бъдат ясно възприети само незначителен набор от химични съединения, най-вече естери, алкохоли и алдехиди (Holland et al., 2005; Ulrich and Dunemann, 2012).

В това проучване беше използвана колекция ябълки, която беше оценена както за текстурата, така и за аромата. Към днешна дата тези две качества на плодовете са оценени само поотделно, поради което липсва цялостно и изчерпателно разследване на връзката им. Анализът на тези набори от данни, използвайки многовариантни статистически подходи [многофакторен анализ (MFA) и анализ на функционални главни компоненти (FPCA)], заедно с платформа за генотипиране на единичен нуклеотиден полиморфизъм с висока плътност (SNP), позволи изследване за асоцииране в целия геном ( GWAS) с цел постигане на напредък в разбирането на генетичната връзка между тези две важни качества на плодовете.

Материали и методи

Растителен материал

В това разследване е избрана колекция от 162 присъединения на ябълки в хранилището на зародишната плазма, достъпно във Fondazione Edmund Mach (Тренто, Италия). Всеки генотип, засаден в три екземпляра, е бил във фаза за възрастни и плододаване по време на анализа. Дърветата бяха поддържани със стандартни агрономически практики за изтъняване на плодовете, резитба и контрол на вредителите/болестите. Ябълките бяха събрани на търговския етап на зреене, определен след промените в цвета на кожата и семената, както и разграждането на съдържанието на хлорофил, оценено без разрушаване с Da-Meter (TR, Forli, Италия; Ziosi et al., 2008). За всяко присъединяване на ябълки се събират минимум 20 хомогенни плода и се съхраняват в продължение на 2 месеца в студена изба (2–4 ° C с

95% относителна влажност). След съхранение след прибиране на реколтата плодовете се отстраняват и се поддържат при стайна температура (

20 ° C) през нощта преди анализ на текстурата и ЛОС.

Фенотипиране на плодова текстура

Подгрупа от пет ябълки на генотип беше използвана за характеризиране на субтитрите на структурата на плодовете. Измерванията бяха извършени с анализатор на текстури (Stable MicroSystem, Godalming, UK). Протоколът е даден подробно в Costa et al. (2011, 2012). Накратко, за всеки генотип бяха извършени 20 измервания (четири технически на пет биологични повторения). Инструментът е оборудван с 4 мм сонда с плоска глава и AED (устройство за акустична обвивка) за едновременно получаване на механичните и акустичните профили, допълнително обработени с ad hoc макрос за цифрово дефиниране на 12 параметъра. От тях осем бяха свързани с механичния подпис на текстурата (сила на провлачване, максимална сила, крайна сила, средна сила, площ, линейно разстояние на силата, модул на Юнг и брой пикове на силата) и четири с акустичната реакция (максимална акустика налягане, средно акустично налягане, акустично линейно разстояние и брой акустични пикове; изцяло описано в Costa et al., 2011 и в Допълнителна таблица S1 на JXB онлайн).

Динамичен VOC пръстов отпечатък в ябълка

целия

Схематично представяне на динамичния VOC пръстови отпечатък на ябълкови плодове, оценен чрез PTR-ToF-MS, съчетан с изкуствено дъвчещо устройство (A), съставено от цилиндрична стъклена кювета (800 ml), запечатана с капачка и назъбен бутал. В (B) се отчита 3D топлинната карта на онлайн VOC динамичния пръстови отпечатък, извършен в „Golden Delicious“, избран за референтен сорт. За графични цели ЛОС се отчитат в намаляващ ред, базиран на първоначалното им ниво (преди дъвчене). Концентрацията на ЛОС в главното пространство беше измерена в продължение на 60 s преди и след смачкване, общо 120 s. За да се опрости анализът на цялото динамично профилиране на ЛОС, са сравнени предимно само три специфични времеви точки от цялата динамика: (а) преди изкуственото дъвчене (0 s), (b) 20 s и (c) 60 s след преработката на плодовете.

SNP генотипиране

Младите листа, събрани от всяко присъединяване на ябълките, се използват за екстракция на нуклеинова киселина. Геномната ДНК беше изолирана с комплект за растения Qiagen DNeasy. Количеството и качеството на ДНК се измерват с Nanodrop ND-8000 (ThermoSciaching, САЩ). 162 присъединявания са генотипизирани с 20K Infinium SNP Array (Illumina), специално предназначен за ябълки (Bianco et al., 2014). Данните за SNP бяха филтрирани с ASSIsT (Di Guardo et al., 2015), като се получи окончателен набор от 11 277 полиморфни маркера. Идентифицирането и изборът на крайния набор от маркери, които да се използват в GWAS, не може да разчита изключително на качествени параметри на SNP (напр. Относително количество пропуснати повиквания, съотношение на честотата на обажданията и изкривяване на сегрегацията), тъй като физическото положение на маркера може се оказват неточни, поради високата хомология на последователността между хомоеологичните хромозоми и високата хетерозиготност на генома на ябълката (Velasco et al., 2010). По този начин, от общия брой SNP маркери, включени в 20K Illumina Infinium Array, 9142 най-накрая бяха използвани за анализ на GWAS. Следователно това подмножество беше надеждно в рамките на 162 присъединявания на ябълки (въз основа на филтрирането, обработено от ASSIsT) и позиционирано на консенсусна генетична карта, описана в придружаващия ръкопис (Di Guardo et al., 2017).

Асоциация на маркер-черта от GWAS

Филтрираните данни за SNP и фенотипната оценка (представени както от текстура, така и от анализ на ЛОС) бяха анализирани съвместно в подход маркер-черта асоциация. За тази цел се използва софтуерът TASSEL v3.0 и се изчислява GWAS, прилагайки два модела: общ линеен модел (GLM) и смесен линеен модел (MLM). GLM (Pritchard et al., 2000) беше извършен, като се вземе предвид популационната структура (Q матрица), за да се коригира генетичната стратификация. Членството на всеки индивид във всяка субпопулация, представено от основни компоненти (PC), беше допълнително добавено към модела като ковариати. Вторият модел, приет тук за намиране на асоциации маркер-черта, е MLM (Yu et al., 2006), който също смята, че матрицата на родството (свързаност на популацията) е коригираща за фалшива асоциация. Този модел се изразява от матрицата на Хендерсен, както следва:

където Y е векторът на наблюдение, β е вектор, съдържащ фиксирани ефекти (включително генетични маркери и популационна структура), u е вектор на случайни адитивни генетични ефекти за множество фонови QTL, X и Z са известните дизайнерски матрици, а e е ненаблюдаваният вектор на случайни остатъци. Избрани са значими асоциации на прага на P-стойност ≤ 0,05, коригирани за множество сравнения съгласно процедурата за фалшиво откриване (FDR), докладвана от Benjiamini и Hochberg (1995), изчислена с пакета „статистика“ на R (R Core Development Екип). Моделът, използван за всяка черта, е избран въз основа на визуалната проверка на Q-Q графика (пакет „qqman’ R).

Статистически анализ

Визуализацията на значими VOC корелации (P 0.50) беше проведена чрез генериране на мрежа за корелационен анализ с Cytoscape (версия 3.2.1; Cline et al., 2007). Приставката ClusterONE (Nepusz et al., 2012) беше използвана за идентифициране на предполагаеми метаболитни клъстери чрез намиране на региони със значителна локална плътност. R 3.2.0 вътрешни статистически функции и външните пакети „ChemometricsWithR“, „FactoMineR“, „Funclustering“, „fda“ и „ggplot2“ бяха използвани за многомерните статистически методи, използвани в тази работа. По отношение на текстурния анализ, всеки комбиниран механично-акустичен профил беше анализиран със софтуера Exponent v4.0 (Stable MicroSystem, Godalming, UK).

Резултати и дискусия

Фенотипиране на VOC с висока разделителна способност

20 s след първоначалното разрушаване на тъканите (допълнителна фигура S1).

Анализ на основния компонент (PCA) (A) и проекция на натоварване (B) на разпределението на ЛОС, оценени от PTR-ToF-MS по време на изкуственото дъвчене. Графиката в (A) изобразява разпределението на VOC профила на сортовете ябълки върху резултата от PCA, дефиниран от първите два основни компонента. В колекцията от гермплазма произволно бяха подчертани девет сорта („Delearly“, „Early Gold“, „Fuji“, „Golden Delicious“, „Granny Smith“, „Murray“, „Pinova“, „Renetta Ananas“ и „Royal Гала '). Различните символи (квадрат, кръг и триъгълник) показват времето за оценка по време на изкуственото дъвчене (0, 20 и 60 s след дъвчене). Всяка точка от данните е средната стойност от пет биологични повторения. Графиката в (B) показва проекцията на 33-те значителни пика на маса на ЛОС, отчетени с използване на различни цветове според химичното семейство. Идентичността на масовия пик е съобщена в допълнителна фигура S2.

Картографиране на летливи QTL

Мрежи за корелационен анализ (CAN) на ЛОС (A) и резултатите от асоциирането в целия геном (от B до F). CAN (A) се получава чрез определяне на значимите корелации на Пиърсън (P Фиг. 3B; Допълнителна таблица S4). Въпреки че най-значимият SNP (RB_1979331_L2_PA) не преминава коригирания праг, този геномен регион съвпадна с MdAAT1. Този ген принадлежи към алкохолното семейство ацил-трансфераза и е известно, че катализира трансацилирането от ацил-КоА до алкохол (естерификация). В няколко плода AAT е от съществено значение за контролиране на биогенезата на вкуса по време на фазата на узряване на плодовете. Всъщност е документирано (Aharoni et al., 2000; Beekwilder et al., 2004; El-Sharkawy et al., 2005; Dunemann et al., 2012), че естерите са най-важните съединения в ароматния букет от плодове . Освен това в ябълките естерите са, наред с други, доминиращото съединение, което допринася 80% от цялата ароматна смес. За този вид беше показано, че експресионният профил на MdAAT1 съответства на производството на естери, а също и на натрупването на етилен (Schaffer et al., 2007). Този ген (MDP0000637737) е извлечен допълнително от геномния сбор на ябълката (база данни на GDR; Jung et al., 2014) в рамките на интервал от 400 kb, установен като степен на неравновесие на връзката (LD), присъстващо в опитомени ябълки (Di Guardo et al ., 2017).

От групата на алдехидните съединения (група 4), QTL са идентифицирани и разположени съответно на хромозома 1 и 7 (съвпадащи с FB_0442970_L1_PA, FB_0697476_L7_PA; Фиг. 3Е; Допълнителна таблица S4). Въпреки че не е идентифициран подходящ ген за хромозома 1, допълнителен ADH ген (MDP0000077529) е анотиран върху хромозома 7. Тази асоциация, заедно със споменатите по-горе гени, засилва ролята на този регион при регулирането между алкохолни и алдехидни VOC категории.

Динамичното профилиране на ЛОС и анализът на GWAS хвърлят светлина върху взаимодействието между производството на летливи вещества и свойствата на плодовата текстура

Многофакторен анализ (MFA) на структурни свойства (механични и акустични) и ЛОС. Графиката в (A) показва MFA проекцията на 33 VOC маси, оценени от PTR-ToF-MS на 60 s след изкуственото дъвчене (сив цвят), заедно с осем механични (оранжев цвят) и четири акустични (черен цвят) параметри. Сюжетът в (B) изобразява йерархичното групиране на 162 сорта ябълки и тяхното разпределение върху графика на MFA, дефиниран от първите две измерения. Ябълковите сортове също са групирани в три значими клъстера, подчертани с три цвята (зелен, червен и син). Подробното йерархично представяне на клъстери също е отчетено в допълнителна фигура S4.

Анализ на функционалния главен компонент (FPCA) на летливия ябълка, оценен с PTR-ToF-MS преди и след обработката. В (А) е показан FPCA парцелът, илюстриращ разпределението на използваните тук 162 сорта ябълки. Идентичността на сорта е описана подробно в допълнителна фигура S5. В сюжета трите клъстера, базирани на йерархичния клъстер на MFA (фиг. 4), също са изобразени съответно със зелени триъгълници (Cl_1), червени кръгове (Cl_2) и сини квадрати (Cl_3). В (B) и (C) се отчитат резултатите за асоцииране в целия геном за PC1 (B) и PC2 (C), съответно. За всеки график в Манхатън се отчитат също Q-Q графикът и прагът за корекция на FDR.

Изборът в полза на твърдостта на плодовете влияе отрицателно върху производството на ЛОС в ябълките

Конфигурация на алелотип MdPG1 и MdACO1 на сортовете ябълки, разпределени в участъка FPCA. За всеки панел зеленият и червеният цвят са за благоприятното и неблагоприятното хомозиготно алелно състояние, докато хетерозиготното алелно състояние се отчита в сиво. Кръговите диаграми, изобразени в (А), показват дела на алела за двата функционални маркера в трите клъстера, дефинирани от MFA анализа. (B) и (C) Разпределението на сортовете на FPCA парцела, оцветено съответно на алелотипа на MdPG1 (B) и MdACO1 (C). В ключа на (B) и (C) е посочен и алелизмът на двата SNP, свързани с двата гена.

Експлоатацията на генетичната променливост, съществуваща в зародишната плазма на ябълката, може да позволи ценна комбинация от алели за избора на висококачествен идеотип. Тази цел обаче може да бъде постигната само с по-информирана и точна идентификация на най-добре представящите се сортове, които да се използват като по-добри родителски линии.

Допълнителен материал

Допълнителни данни

Благодарности

Авторите искат да благодарят на Elisa Banchi за генотипирането на SNP и на Marco Fontanari за ценната му подкрепа при фенотипирането на текстури.