РЕЗЮМЕ

ВЪВЕДЕНИЕ

Медта е основен микроелемент, необходим за жизненоважни биологични функции както в прокариотните, така и в еукариотните клетки (29). Отговорът на растежа при прасенцата към медта е независим от - и в допълнение - от отговора на често използваните антибиотици във фуражите (16). Медта в излишни концентрации е токсична за клетките, тъй като предизвиква производството на вътреклетъчни реактивни кислородни радикали, които инактивират клетъчните компоненти като нуклеинови киселини, липиди и протеини (32). Следователно клетките регулират плътно вътреклетъчните концентрации на мед, за да се избегне токсичност (43). Медният механизъм на хомеостазата е добре проучен при някои Грам-положителни бактерии, като Enterococcus hirae, Lactococcus lactis и Bacillus subtilis (45). Нормалната вътреклетъчна концентрация на мед се поддържа от copYZAB оперона, където copA и copB кодират медни транспортни АТФази, отговорни съответно за притока и изтичането на мед. Генът на copY действа като меден реагиращ репресор и copZ кодира меден шаперон (46).

проявяващи

(Част от тази работа беше представена на Втората конференция на Американското общество за микробиология по антимикробна резистентност при зоонозни бактерии и хранителни патогени, Торонто, Канада, от 8 до 11 юни 2010 г., и на Третата конференция на Американското общество по микробиология за ентерококи, Портланд, Орегон, 30 юли до 2 август 2010 г.)

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Животни, експериментален дизайн и вземане на проби. Използването на животни и последваната експериментална процедура бяха одобрени от Комитета за грижа и употреба на животните в Канзаския държавен университет. Шестдесет новоотгледани прасенца (на 21 дни) със средно телесно тегло 7,0 kg (± 1 kg) бяха разпределени на случаен принцип за две диетични процедури. Двете диетични лечения бяха, както следва: базална диета с 16,5 ppm мед (контролна група) или базална диета, допълнена със 125 ppm мед като меден сулфат (медна група). Базалната диета се състоеше от царевица, соево брашно, витамини, аминокиселини и минерални добавки, а прасенца бяха настанени в контролирано от околната среда детско заведение. Всяка третирана група имаше общо 30 прасенца, разпределени в 5 кошари с 6 прасенца на кошара. Всяка писалка е снабдена със самозахранващо устройство, съдържащо четири отвора и водно зърно, така че животните да имат свободен достъп до храна и вода. Всяка писалка имаше под с телена мрежа, който позволяваше 0,3 м 2 на прасенце. Прасенцата са хранени с диети за лечение в продължение на 42 дни. Фекални проби бяха събрани на случаен принцип от 3 прасета във всяка кошара в дни 0, 14, 28 и 42, поставени в отделни торбички и транспортирани до лабораторията върху лед.

Изолиране на ентерококи. Освен ако не е споменато друго, всички използвани културни среди са от Difco (Becton Dickinson, Sparks, MD). Фекалните проби се обработват чрез разреждане на 1 g фекалии в 10 ml буфериран с фосфат физиологичен разтвор и разстилане на 50 μl суспензия върху агар M-Enterococcus. Плаките се инкубират в продължение на 24 часа при 37 ° С. Пет колонии (точно червено, розово или метално розово) бяха взети, нанесени върху плочи с кръвен агар и инкубирани една нощ при 37 ° С. Всички изолати бяха тествани за ескулинова хидролиза чрез инокулиране в 100 μl бульон Enterococcosel в 96-гнездова микротитърна плака (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) и инкубиране при 37 ° С в продължение на 4 часа. Три положителни за ескулин хидролиза изолати на фекална проба (9 на писалка и 45 на третиране във всяко време за вземане на проби) се съхраняват с помощта на Protect мъниста (Cryocare; Key Scientific Products, Stamford, TX) при -80 ° C до следваща употреба.

PCR за откриване на tcrB гена. Генът tcrB се открива съгласно процедурата, описана от Hasman et al. (20). Всеки изолат от единичен протекторен гранул се нанася върху плоча с кръвен агар и се инкубира през нощта при 37 ° С. Бактериалната ДНК се екстрахира чрез суспендиране на една колония във вода без нуклеаза със смола Chelex 100 (Bio-Rad Laboratories, Херкулес, Калифорния) и кипене в продължение на 10 минути (4). TcrB-позитивен щам E. faecium (7430275-4 или 7430272-6; любезно предоставен от Хенрик Хасман, Национален хранителен институт, Технически университет в Дания) служи като положителен контрол.

Спецификация на tcrB-положителни ентерококи. Идентификацията на видовете ентерококови изолати, които са били tcrB положителни и равен брой tcrB-отрицателни изолати, произволно избрани от контролната и лечебната група, е извършена чрез мултиплекс PCR, който идентифицира E. faecium, E. faecalis, E. gallinarum и E. casseliflavus (24). Освен това за потвърждаване на вида се използва анализ на генната последователност на супероксиддисмутаза (sodA) (42). ДНК шаблонът беше изготвен, както беше споменато по-горе. Щамовете ATCC (Manassas, VA) на E. faecium (ATCC 19434), E. faecalis (ATCC 19433), E. gallinarum (ATCC 49579) и E. casseliflavus (ATCC 25788) служат като положителни контроли. Основните смеси, праймери и условия на работа за мултиплекс PCR и sodA ген PCR са описани от Jackson et al. (24) и Poyart et al. (42), съответно. Генните продукти на sodA се пречистват чрез гел Wizard SV и система за почистване на PCR (Promega, Madison, WI). Пречистените PCR продукти бяха секвенирани в Genomics Core, Институт за интегративна биология на генома, Калифорнийски университет в Ривърсайд. Последователностите бяха анализирани чрез BLAST търсене в базата данни на NCBI GenBank.

Откриване на erm (B) и vanA гени. Праймерите и PCR условията за откриване на erm (B) и vanA гени са съгласно работата на Jacob et al. (26) и Kariyama et al. (27), съответно. Enterococcus faecalis MMH 594 (предоставен от Lynn Hancock, Катедра по биология, Канзаския държавен университет) и E. faecium (ATCC 51559), служат като положителни контроли за гените erm (B) и vanA, съответно.

Определяне на чувствителността на мед. Определянето на чувствителност към мед за tcrB-положителни и равен брой tcrB-отрицателни ентерококови изолати се извършва по метода на разреждане на агар (19, 20). Двата щама от Дания (7430162-6 и 7430275-4) бяха включени като положителни контроли. Агарови плочи на Mueller-Hinton (MH), приготвени с концентрации на мед, добавени като меден сулфат (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ), при 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, или 40 mM и с рН, коригирано до 7,0. Плочките бяха инокулирани на място с 20 μl бактериална култура, която беше адаптирана към стандарт за мътност на McFarland. 0,5 (Remel, Lenexa, KS) и се инкубира при 37 ° С за 48 h, за да се определи растеж или липса на растеж. Определянията на чувствителността се повтарят в друг ден с различни инокулатни препарати.

Определяне на чувствителността към антибиотици. Методът за разреждане с микроброт е използван за определяне на MIC за еритромицин и ванкомицин (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури) съгласно насоките на CLSI (11). Основните разтвори на антибиотици, всеки съдържащ крайна концентрация от 1000 μg/ml въз основа на потентността, се приготвят в стерилна дестилирана вода. Бактериалните култури се приготвят чрез инокулиране на една колония в 10 ml MH бульон, инкубиране в продължение на 6 часа и след това разреждане на 100 пъти със стерилен MH бульон. Антибиотиците бяха тествани при концентрации 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56, 0,78, 0,39, 0,195 и 0,098 μg/ml. Тестът за антимикробна чувствителност се извършва в 96-ямкови микротитърни плаки (Becton Dickinson) и инокулираните плаки се инкубират при 37 ° С в продължение на 24 часа и резултатите се записват като растеж или без растеж. Определянето на MIC се повтаря на друг ден с различни инокулатни препарати.

Междувидова преносимост на tcrB гена. Извършен е анализ на конюгацията, като се използва процедурата за чифтосване на филтъра (47). TcrB-позитивните донорни щамове (5 E. faecium и 5 E. faecalis щамове) бяха устойчиви на тетрациклин [MIC> 100 μg/ml; тет (М) положителен] и податлив на спектиномицин [MIC = 12,5 μg/ml]. E. faecium щам TX 5034 (предоставен от Barbara Murray, University of Texas Medical School), устойчив на спектиномицин (MIC> 100 μg/ml) и tet (M) отрицателен и податлив на тетрациклин (MIC = 0.78 μg/ml), и Като реципиент са използвани щам E. faecalis OG1SSp (предоставен от Ludek Zurek, Държавен университет в Канзас), устойчив на спектиномицин (MIC> 100 μg/ml) и tet (M) отрицателен и чувствителен към тетрациклин (MIC = 0,39 μg/ml). щамове. Донорите и реципиентите се отглеждат на BHI агарови плаки, съдържащи тетрациклин (40 μg/ml) и спектиномицин (500 μg/ml), съответно. Получените трансконюганти се избират върху BHI агарови плаки, съдържащи както тетрациклин, така и спектиномицин. Трансконюгантите бяха тествани за tcrB и erm (B) гени чрез PCR и тяхната чувствителност към мед беше определена, както е описано по-горе. Честотата на трансфер за всеки щам се изчислява като CFU на трансконюгантите на CFU реципиент.

Разпространение на tcrB-положителни фекални ентерококи при прасенца, хранени с диети, допълнени със или без мед

(а) Модели на гел-електрофореза с импулсно поле на усвоена от SmaI геномна ДНК на tcrB-положителни изолати на Enterococcus faecium от прасенца, хранени с диети, допълнени със или без мед. (b) Модели на гел-електрофореза с импулсно поле на усвоена от SmaI геномна ДНК на tcrB-положителни изолати на Enterococcus faecalis от прасенца, хранени с диети, допълнени със или без мед.

Южна хибридизация. Рестрикционното усвояване на геномната ДНК на E. faecium или E. faecalis с S1 нуклеаза дава отчетлива лента с размер ~ 194 kbp (фиг. 2). Рестрикционното смилане на tcrB-отрицателен E. faecium или E. faecalis с S1 нуклеаза не дава 194-kbp ленти, но показва ленти с размер от 150 до 170 kbp (данните не са показани). И в трите тествани tcrB-положителни E. faecium и E. faecalis изолати, както tcrB, така и erm (B) генните сонди, хибридизирани с лентата ∼194-kbp (Фиг. 2). В случай на tcrB-отрицателни щамове E. faecium или E. faecalis, както се очаква, не се наблюдава хибридизация с tcrB генна сонда; генната сонда на erm (B) обаче се хибридизира с ленти от 150 до 170 kbp (данните не са показани).

Хибридизация на tcrB и erm (B) сонди към S1-усвоена нуклеазна геномна ДНК на три ентерококови щама. Пътища: 1, средночестотен маркер PFG II; 2 и 3, геномна ДНК на изолати на E. faecium, усвоени с ензим S1 нуклеаза; 4, геномна ДНК на изолат на E. faecalis, усвоен с ензим S1 нуклеаза; 5, 6 и 7, Southern blot хибридизация с tcrB сонда; 8 и 9, геномна ДНК на изолати на E. faecium, усвоени с ензим S1 нуклеаза; 10, геномна ДНК на изолат на E. faecalis, усвоен с ензим S1 нуклеаза; 11, 12 и 13, Southern blot хибридизация с erm (B) сонда.

Междувидова преносимост на tcrB гена. Пет от всеки от tcrB-положителните изолати на E. faecium и E. faecalis бяха използвани, за да се демонстрира междувидовата преносимост на tcrB гена чрез конюгация. 10-те получени трансконюганти са положителни за tcrB, erm (B) и tet (M) гени. Както се очаква, трансконюгантите растат върху MH агар, съдържащ високи концентрации на мед (16 или 20 mM). Средният MIC на медта от 10-те трансконюганти е 18.4 mM. Средните честоти на трансфер за tcrB-положителните изолати на E. faecium и E. faecalis са съответно 9,3 × 10 −6 и 8,2 × 10 −6 (Таблица 2).

Честота на трансфер на tcrB гена в Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis

ДИСКУСИЯ

При прасенцата медта се добавя към диетите при концентрации над тези, които физиологично се изискват от животното поради неговите стимулиращи растежа ефекти (38). Точният механизъм на действие на медта като стимулатор на растежа не е изяснен, но предлаганите механизми, приписвани на антимикробните ефекти на медта, включват променени микробни популации на червата, повишена наличност на хранителни вещества и енергия поради намалената микробна активност в червата и вероятно потискането на ентеричните бактериални патогени (18, 23). В европейските страни медта се добавя в диетата на свинете при повишени нива, често като заместител на антибиотиците в храната, които са забранени за използване като стимуланти на растежа от средата на 90-те години (3, 21).

СТЪПКИ