Резюме

скелетното разтоварване предизвиква остеопения (3, 4, 10, 19, 26, 29–31). Прогресивната загуба на кост, която се случва по време на разтоварването, е до голяма степен следствие от намаляване на набирането и активността на остеобластите (8, 9, 11, 18, 30).

Инсулиноподобният растежен фактор (IGF) -I, мощен анаболен агент за костите, насърчава пролиферацията на остеопрогенитори, образуването на остеобласти и оцеляването на остеобластите и стимулира образуването на кости (6, 7, 25). Намаляването на остеобластната активност и загубата на кост, предизвикани от скелетно разтоварване, са свързани със загуба на костна реакция към анаболните действия на IGF-I (5, 12, 20, 22). Скелетното разтоварване с помощта на модел за издигане на задния крайник на плъх нарушава активирането на IGF-I рецептора, нарушава предаването на сигнала на IGF-I и инхибира образуването и активността на остеобластите (5, 20, 22).

Въпреки че скелетното разтоварване и механизмите, отговорни за загубата на кост, са добре проучени, какво се случва с костта, когато скелетът се презареди след период на разтоварване, е получил по-малко внимание. Костта, загубена по време на космически полет или в модели, имитиращи безтегловността на космическия полет, се възстановява поне частично след връщане към нормално натоварване или носене на тежести, но процесът е изключително бавен (1, 2, 14, 15, 23, 28). Пълното възстановяване може никога да не настъпи. При космически полети с продължителност 14 дни скелетната маса при плъховете намалява. Четиринадесет дни след връщане към нормална амбулация, костно образуването се съобщава за увеличено, но все още не е настъпило общо възстановяване на костната маса (14, 32). При проучванията за почивка при хора, костите също се губят и възстановяването може да изисква 6 месеца или повече нормална амбулация (16). Тези проучвания показват, че костта, загубена по време на скелетно разтоварване, може да бъде възстановена, поне отчасти, с връщане към нормалното носене на тегло, но процесът е бавен и рискът от фрактура през този период може да бъде увеличен.

Въз основа на наблюдението, че скелетното разтоварване предизвиква резистентност към IGF-I, ние предположихме, че презареждането след период на разтоварване ще увеличи реакцията на костите към IGF-I и ще насърчи възстановяването на скелета. За да тестваме тази хипотеза, изследвахме костната структура и образуване в отговор на IGF-I при натоварени (нормални амбулаторни), разтоварени (издигане на задните крайници) и разтоварени/претоварени плъхове.

Животни

Четиридесет и осем мъжки плъхове Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA; 3 месеца на възраст) бяха използвани за това проучване. Скелетното разтоварване беше предизвикано, използвайки модела на кота на задния край или окачване на опашката (10, 19, 31). Животните бяха разделени на шест групи по осем животни всяка. Те или бяха нормално натоварени за 4 седмици, разтоварени за 4 седмици, или разтоварени за 2 седмици и след това претоварени за 2 седмици. Всяка група беше третирана или с носител, или с IGF-I (2.5 mg · kg -1 ден на -1), използвайки осмотични мини помпи (Durect, Купертино, Калифорния) за последните 2 седмици. Интервалите от време, избрани за разтоварване и презареждане, се основават на предишни проучвания, които показват, че 2 седмици разтоварване водят до явно намаляване на скоростта на костно образуване и загуба на обем на костната обвивка и че 2 седмици презареждане инициират увеличаване на костното образуване и възстановяване на костния обем (23). Животните се хранят по двойки и се претеглят ежедневно. За измерване на костната формация, 2 седмици и 2 дни преди евтаназията, плъховете се инжектират подкожно с калцеин (15 mg/kg) и демеклоциклин (20 mg/kg), съответно, за обозначаване на минерализиращите повърхности.

По време на евтаназията от коремната аорта се събира кръв и се събира серум за определяне на IGF-I. Лявата пищял и вторият лумбален прешлен са получени за измерване на обезмаслено тегло и за микрокомпютърна томография. Дясната пищял е получена за измерване на скоростта на образуване на периосталната кост. Тези проучвания са одобрени от Комитета за грижа и употреба на животните към Медицинския център по въпросите на ветераните в Сан Франциско.

Процедура за сканиране с микрокомпютърна томография

Пищялите и прешлените се почистват от прилепнала мека тъкан и се екстрахират в етанол (24 часа) и диетилов етер (24 часа) с помощта на апарат за сокслет (Fisher Scientific, Pittsburg, PA). Костите се сушат при 100 ° С и се претеглят, за да се определи теглото без мазнини. Същите кости бяха анализирани с помощта на микрокомпютърна томография (Scanco Medical, Цюрих, Швейцария).

Първична спонгиоза.

Проксималните краища на пищялите са сканирани от върха на епифизата дистално до средата на вторичната спонгиоза, за да се включи цялата първична спонгиоза. Размерът на изотропния воксел (обемен пиксел) е номинално 10,5 μm. Рентгеновата енергия беше 55 kV. Вътрешната структура на първичната спонгиоза представлява сложна комбинация от минерализирана тъкан, костен мозък и хрущял. За да се направи по-добра разлика между тези различни структури, ние задаваме времето за интегриране на 1 s, за да оптимизираме съотношението сигнал/шум.

Напречните сечения на костта бяха преформатирани в надлъжни разрези, за да позволят на потребителя визуално да разпознава и изолира първичната спонгиоза, региона на интерес (ROI). Границите на възвръщаемостта на инвестициите бяха растежната плоча на проксималната повърхност и края на костните спикули от дисталната страна. Кортексите бяха страничните граници.

Вторична спонгиоза.

Регионът на анализ за проксималната пищял се определя по следния начин. Триста резена (16 μm воксели) бяха сканирани дистално от дъното на растежната плоча. Първите 100 резена (1.6 mm) бяха изхвърлени и беше анализиран районът от 1.6 до 4.8 mm под растежната плоча. Областта на анализ за прешлените включва цялото гръбначно тяло, с изключение на кортикалната кост.

Анализ на сканиране с микрокомпютърна томография

Приложен е глобален праг за сегментиране на минерализирани от меки тъкани (постно и мастен мозък). Във вторичната спонгиоза прагът беше определен като 22% от максималната възможна стойност, съответстваща на праг от 220 в единица „на милион“. Трабекуларното число (Tb.N; 1/mm), дебелината (Tb.Th; μm) и разстоянието (Tb.Sp; μm); плътност на свързаност (Conn-dens; 1/mm 3), индекс на структурен модел (SMI; варира от 0 до 3 с 0 = подобен на плоча и 3 = пръчковиден) и минерална плътност на костите (BMD; mg хидроксиапатит/cm 3) са изчислени с помощта на софтуер предоставено от Scanco (Scanco Medical). КМП е средната плътност на сегментираната фракция на възвръщаемостта на инвестициите (костите), без да включва костномозъчната фракция. BMD се извлича от линейния коефициент на затихване на рентгеновите лъчи след калибриране с фантом с известна плътност на хидроксиапатитите.

Средната плътност на минерализираната тъкан в първичната спонгиоза е средно по-ниска от плътността на спонгиозната кост във вторичната спонгиоза и обхваща широк диапазон от най-ниската в близост до хипертрофичната хондроцитна зона до най-високата в костните спикули. За да се приспособи по-ниската плътност в първичната спонгиоза, прагът беше фиксиран като 20% от максимално възможната стойност, съответстваща на праг от 200 в промиле единица. Предварително дефинираният праг също беше проверен от оператора, за да съответства на минерализираните тъкани, както се появяват на микрокомпютърната томография в надлъжни разрези.

Костна хистоморфометрия

Скоростта на образуване на околокостната кост е измерена в тибиофибуларната връзка (TFJ) (ненатоварена кост в нашия модел) и midhumerus (натоварена кост в нашия модел). Тибиите и хумерите се фиксират в 4% фосфатно буфериран формалин за 24 часа, дехидратират се при нарастващи концентрации на етанол и се обезмасляват в абсолютен ацетон, последван от етер. Костите са вградени в биопластмаса (Tap Plastics, Дъблин, Калифорния). След полимеризация през нощта при 60 ° C, срезове (100 μm) бяха изрязани с помощта на циркуляр за кости Leica SP 1600 (Leica, Deerfield, IL) и скоростта на костно образуване беше измерена, както е описано по-рано, като се използва търговска програма за анализ на изображения (BIOQUANT Image Анализ, Нешвил, Тенеси) (11).

Серум IGF-I

Нивата на серумен IGF-I се определят, като се използва IGF-I (IGF свързващ протеин, блокиран) RIA, произведен от American Laboratory Products (ALPCO, Windham, NH), както е описано по-рано (20). Изчислената чувствителност на анализа е 0,02 ng/ml. Кръстосаната реактивност с IGF-II е малка (

инсулиноподобен

Фиг. 1.Серумни концентрации на инсулиноподобен растежен фактор I (IGF-I) при ден 28. Стойностите са средни стойности ± SD. Лечението с IGF-I увеличава серумните концентрации от 599 ± 43 ng/ml при третирани с носител животни до 1024 ± 41 ng/ml при животни, третирани с IGF-I. §P

Тегло без мазнини в пищяла (нормализирано към телесното тегло) не се различава между групите (фиг. 2), въпреки че има тенденция нивата да бъдат по-ниски при лекувани с превозни средства, разтоварени животниP = 0,06). Обезмаслените тегла бяха нормализирани, за да се коригира малкият диференциал в телесното тегло при ден 28.

Фиг. 2.Обезмаслено тегло на пищяла, нормализирано до телесно тегло при ден 28. Стойностите са средни стойности ± SD. Костните тегла бяха нормализирани, за да се коригира малкият диференциал в телесното тегло при ден 28. Няма значителни разлики между групите (двупосочна ANOVA).

Скоростите на образуване на околокостната кост при TFJ и midhumerus са показани на фиг. 3, A и Б., съответно. При третирани с превозни средства животни скелетното разтоварване намалява образуването при TFJ от 17 ± 6 на 6 ± 3 × 10 3 μm 2/ден (P 3 μm 2/ден (P 3 μm 2/ден или 238% (P 3 μm 2/ден) и третирани с IGF-I животни (16 × 10 3 μm 2/ден) е> 700%. Флуорохромното маркиране на периосталната повърхност е показано на фиг. 3, ° С и д, за претоварени животни, третирани съответно с носител или IGF-I. Раменната кост, която обикновено е натоварена и действа като контролна кост в нашия модел, реагира на IGF-I, но не е засегната от състоянието на натоварване (Фиг. 3Б.). Степента на образуване при третирани с IGF-I животни е била с %60% по-висока (P

Фиг. 3.Ефекти от лечението с IGF-I и разтоварването на скелета върху скоростите на формиране на периосталната кост (BFR) в тибиофибуларната връзка (TFJ, ненатоварена кост в нашия модел) (A) и средния вал на раменната кост (нормално натоварена кост в нашия модел) (Б.). Стойностите са средни стойности ± SD. Двойни флуорохромни етикети (калцеин и демеклоциклин) са дадени съответно на 2 седмици и 2 дни преди евтаназия за измерване на скоростта на образуване на костната кост. ° С и д покажете моделите на етикетиране на флуорохром за презаредено превозно средство (° С) и презареди лекувани с IGF-I животни (д). В A: *P

Разтоварването на скелета е довело до загуба на обем на кост в проксималната част на пищяла (Фиг. 4A) и прешлен (фиг. 4Б.) и при третирани с носител, и с IGF-I животни. В пищяла, презареждането в продължение на 2 седмици увеличава обема на спонтанната кост при животни, лекувани с IGF-I, но не третирани с носител. В прешлените презареждането не е довело до значително увеличение на обемите на костите нито при третирани с носител, нито при IGF-I животни.

Фиг. 4.Ефекти от лечението с IGF-I и скелетното разтоварване върху съотношението обем на костния обем към общия обем на тъканите (BV/TV) в проксималната пищяла (A) и лумбалния прешлен (Б.). Стойностите са средни стойности ± SD. Обемът на костите се оценява чрез микрокомпютърен томографски анализ, както е описано в материали и методи. *P

Промените в обема на костите, предизвикани от лечението с IGF-I и скелетното разтоварване, са свързани със специфични промени в костната структура (Таблици 1 и 2). Във вторичната спонгиоза на пищяла Tb.Th намалява с разтоварване и след това се увеличава с презареждане при третирани с IGF-I животни (Таблица 1). Tb.Th не се променя значително при разтоварване при третираните с превозни средства животни, но при претоварване се увеличава значително в сравнение със състоянието на разтоварване. В прешлените Tb.Th намалява както при животни, третирани с носител, така и при IGF-I, но не се увеличава с презареждане (Таблица 2). Плътността на свързаността намалява с разтоварване в пищялите, но не и в прешлените. SMI се увеличава (трабекулите стават по-подобни на пръчки в структурата) както в пищялите, така и в прешлените на третирани с превозни средства и IGF-I животни по време на разтоварването и се връщат в по-подобна на плоча структура по време на претоварването, с изключение на прешлените при третирани с превозни средства животни. Не са наблюдавани промени в сегментираната КМП.

маса 1. Ефекти от лечението с IGF-I и разтоварването на скелета върху структурата на кост на спонтанната кост в проксималната пищяла

Стойностите са средни стойности ± SD. Товар, нормално натоварен за 4 седмици; Разтоварване, разтоварване за 4 седмици; Презареждане, разтоварено за 2 седмици и презаредено за 2 седмици. Лечението се прилага от подкожни минипомпи за последните 2 седмици. [Носител или подобен на инсулин растежен фактор I (IGF-I).] Tb.N, трабекуларен номер; Tb.Th, трабекуларна дебелина; Tb.Sp, трабекуларно разстояние; Conn-dens, плътност на свързаността; SMI, индекс на структурен модел; сегментирана КМП, средна плътност на трабекулите, HA, хидроксиапатит. Значителните разлики бяха оценени с еднопосочен дисперсионен анализ, последван от Holm-Sidac post-hoc тест.

* Значително различен от съответния контрол на натоварването, P † Значително различен от съответното разтоварване, P

Таблица 2. Ефекти от лечението с IGF-I и скелетното разтоварване върху структурата на спонгиозната кост във втория лумбален прешлен

Стойностите са средни стойности ± SD. Значителните разлики бяха оценени с еднопосочен дисперсионен анализ, последван от Holm-Sidac post-hoc тест.

* Значително различен от съответния контрол на натоварването, P † Значително различен от съответното разтоварване, P

Фиг. 5.Микрокомпютърна томография триизмерно представяне на първичната спонгиоза на проксималната тибия (A) и двуизмерна секция за микрокомпютърна томография на проксималната пищяла (Б.). Растежната плоча не е затворена (върхове на стрелки) и първичната спонгиоза е значително по-голяма (стрелки) при третирани с IGF-I презаредени плъхове.


Фиг. 6.Ефект от лечението с IGF-I и скелетното разтоварване върху общото (A) и калциран (Б.) обеми на първичната спонгиоза. Стойностите са средни стойности ± SD. Обемите се оценяват чрез микрокомпютърна томография, както е описано в материали и методи. *P

Сходството в телесното тегло в лекуваното с превозно средство и отделно в групите, лекувани с IGF-I, предполага, че промените в костите, свързани с разтоварване, не са следствие от промени в телесното тегло. Животните, получаващи IGF-I, взети заедно, са значително по-тежки от третираните с превозни средства животни. Тези открития са в съответствие с покачването на серумния IGF-I при лекувани животни и очаквания отговор на анаболните действия на IGF-I.

Въпреки че няма значителна промяна в теглото без мазнини сред групите, разтоварването води до малка (9%) загуба на костна маса. Това се наблюдава и при 6-месечни плъхове, при които скелетното разтоварване за 4 седмици намалява костната маса с ~ 10% (9). При проучвания при млади плъхове (на 6 седмици) скелетното разтоварване води до много по-голям дефицит в костите (12–25%) за много по-кратко време (2 седмици) (10, 23). Това може да се обясни с високата скорост на метаболизма и бързата обмяна на костите при младите животни. Очаква се високият костен обмен да осигури по-голяма възможност за загуба или натрупване на костна маса и може да обясни защо по-възрастните животни реагират по-бавно на разтоварване по отношение на промените в теглото без мазнини и обема на костите.