Резюме

Въведение

Синдромът на поликистозните яйчници (PCOS) е хетерогенно ендокринно разстройство, което засяга 6–10% от жените в репродуктивна възраст по света (1). Около половината от засегнатите жени имат метаболитна дисфункция (напр. Инсулинова резистентност) дори при липса на затлъстяване (2). Тъй като патологичните характеристики, присъстващи при СПКЯ, включително хиперандрогенемия, хиперинсулинемия, хиперсекреция на лутеинизиращ хормон (LH) и хиперлипидемия, често съжителстват, различаването на относителния принос на всяка хормонална и метаболитна аномалия към дисфункцията, налична при СПКЯ, е трудно.

индуцираното

В опит да разгадае патофизиологията на мултиорганната и мултихормонална дисфункция на СПКЯ, нашата лаборатория използва специфично за тъканите нарушаване на ключови гени на пътя в засегнатите органи. По-рано съобщавахме, че хиперинсулинемията при затлъстели мишки се свързва с LH хиперсекреция, женско безплодие и хипертестостеронемия, подобно на някои жени с PCOS. Нарушаването на инсулиновия рецептор (IR), особено при гонадотрофите, частично възстановява плодовитостта, което показва, че инсулиновата сигнализация в гонадотрофа играе роля в репродуктивните аномалии, наблюдавани при индуцирано от затлъстяването безплодие (3). Фенотипът на безплодието обаче беше спасен само частично от загубата на инсулинова сигнализация в гонадотрофа, което показва, че затлъстяването допринася за безплодието чрез ефекти другаде в репродуктивната ос.

Индуцираното от диетата затлъстяване (DIO) женски мишки показват високи серумни нива на тестостерон, подобни на някои жени с PCOS. Стъпката за ограничаване на скоростта в андрогенната биосинтеза се медиира от цитохром Р450 17а хидроксилаза/17, 20 лиазен ензим, кодиран от гена Cyp17 (4). Този ензим има две ензимни функции: посредничи 17-а-хидроксилирането на прогестерон или прегненолон и последващото превръщане в дехидроепиандростендион или андростендион, съответно. При женските гризачи активността на P450Cyp17 присъства предимно в тека-интерстициалните (TI) клетки на яйчника, което ги прави основен източник на андроген, тъй като надбъбречната жлеза на мишката не произвежда андроген (5).

Експресията на Cyp17 не само реагира на LH от хипофизата, но може да се регулира и от други паракринни и ендокринни сигнали като IGF1 и инсулин. Например, намаляването на серумните нива на инсулин с помощта на метформин (6) намалява секрецията на серумен 17 α-хидроксипрогестерон в отговор на агонисти на гонадотропин-освобождаващ хормон (GnRH), което предполага, че хиперинсулинемията може да играе роля при високия андрогенен синтез. Някои от тези ефекти могат да бъдат медиирани индиректно чрез повишена секреция на LH на хипофизата; обаче инсулинът може да служи като когонадотропин на яйчниците, за да допринесе за повишен синтез на андроген при затлъстяване. In vitro инсулинът стимулира секрецията на андроген на яйчниците в яйчниковите клетки на човека и животните (7–11). IR са локализирани в TI клетките на яйчниците (12,13) ​​и медиират действието на инсулина върху стероидогенезата in vitro (10,14,15) чрез стимулиране на андрогенната секреция самостоятелно или увеличаване на LH-индуцираната андрогенна секреция (7,10,16).

Овариалната стероидогенеза се появява в отговор на инсулин в яйчниците на жени с СПКЯ (10), дори в условията на периферна инсулинова резистентност, което предполага, че инсулиновата сигнализация на яйчниците се регулира по различен начин от инсулиновата сигнализация в други органи при хиперинсулинизъм. Специфични за тъканите разлики в инсулиновата резистентност са наблюдавани в проучвания от нашата лаборатория, които показват, че затлъстелите женски мишки с инсулинова резистентност в черния дроб, мускулите и мазнините запазват чувствителността си към инсулина в хипофизата и яйчниците (17). Следователно, базалната инсулинова сигнализация в хипофизата и яйчниците се увеличава в условията на свързана със затлъстяването хиперинсулинемия.

По този начин анатомичните и функционални доказателства оправдават анализ на физиологичната и патологичната роля на инсулиновата сигнализация в тека клетките в развитието и функцията на яйчника. Следователно, ние разработихме модел на мишка, при който IR беше специално изтрит в TI клетките на яйчника, използвайки CRE/LoxP технология.

Изследователски дизайн и методи

Модели на мишката

Floxed-IR мишки са получени от д-р C. Ron Kahn и са описани по-рано (18). Мишки Cyp17iCre са описани от Bridges et al. (19). Мишките с нокаут Cyp17IR (KO) (Cyp17IRKO) са генерирани чрез чифтосване на хомозиготни женски (Cyp17iCre -/-; fl/fl-IR) с хетерозиготни мъжки мишки (Cyp17iCre +/−; fl/wt-IR) мишки. DIO мишки са генерирани, както е описано по-рано (17), при които 2-месечни женски мишки са били хранени с 60% диета с високо съдържание на мазнини (HFD). Като контрола бяха използвани мишки с генотипиране (Cyp17iCre -/-; fl/fl или fl/wt-IR). Измерват се телесна маса на мишки и глюкоза на гладно през нощта на възраст 6 месеца. Всички процедури бяха извършени с одобрението на Комитета за грижа и употреба на Джон Хопкинс.

Генотипизиране и екстракция на ДНК

Праймерите за IR са описани (20). Тези праймери ще открият дивия тип (WT) лента (280 bp), fl/fl лента (320 bp) и KO лента (220 bp). Праймери за Cyp17iCre бяха както следва: cypcre-F, TCTGATGAAGTCAGGAAGAACC; и cypcre-R, GAGATGTCCTTCACTCTGATTC (19). ДНК беше извлечена, както е описано по-рано (21).

Хормонални и глюкозни тестове

Тест за стимулиране на GnRH и глюкоза

Базалните сутрешни нива на LH и фоликулостимулиращ хормон (FSH) са измерени чрез Luminex анализ, както е описано по-рано (21). Инсулинът и лептинът са измерени чрез Luminex assasy (17) от мишки, които са гладували през нощта. Андростендионът, тестостеронът и естрадиолът са измерени от Центъра за изследвания в репродукцията, анализ на лигандите и анализ на Университета във Вирджиния LH също се измерва след стимулация на GnRH, както е описано по-рано (3). Мишките на гладно през нощта се инжектират с 2 g/kg телесно тегло (BW) декстроза и глюкозата се записва на 0, 15, 30, 60, 90 и 120 минути, както беше описано по-рано (17).

Изследване за пубертет и плодовитост

Пубертетът и естрозната цикличност са анализирани, както е описано по-рано (21). Плодовитостта е оценена, както е описано по-рано (3,21). Накратко, 5-месечните женски мишки са били чифтосвани с доказани фертилни мъжки мишки и нивата на плодовитост са оценени като процент от четирите опитвания за чифтосване, които са довели до бременност, както беше описано по-рано (3).

Количествена PCR в реално време

РНК на яйчника се извлича от Trizol (Invitrogen, Grand Island, NY) съгласно протокола на производителя. Общата РНК (1 ug) се транскрибира обратно (iScript cDNA Synthesis Kit; BioRad, Hercules, CA) в cDNA. нивото на иРНК на гени (Cyp17, Cyp19, StAR и LHR), свързани с производството на андроген в яйчника, бяха измерени чрез iQ SYBR зелено, съгласно протокола на производителя (Bio-Rad). Грундове за Cyp17 бяха смисъл 5′-GATCTAAGAAGCGCTCAGGCA3 ′ и антисенс 5′-GGGCACTGCATCACGATAAA-3 ′ (22), за Cyp19 смисъл 5′-TTGGAAATGCTGAACCCCAT-3 ′ и антисенс 5′-CAAGAATCGAA-GA-5G-5G-CAAGAGCAGGGGGGGGTGGGGGG ′ -CCCAAAGAAGGCATAGCAAG-3 ′ и антисенс 5′-GCTGAATCCCCCAAACTTCT-3 ′, а за LH рецептор (LHR) смисъл 5′-GACCAAAAGCTGAGGCTGAGA и антисенс 5′-CAATGTGGCCATCAGGGTAGA-.

Количествената PCR на Taqman (Bioresearch Technologies, Novato, CA) се извършва за IR и като вътрешен контрол се използва GAPDH. Праймерите за IR бяха смислени 5′-ATGGGCTTCGGGAGAGGA-3 ′ и антисмислени 5′-GGATGTCCATACCAGGGCAC-3 ′ със сондата 5′-TGAGACGACGGCTGTGCCATT-3 ′ с етикет 5-карбоксифлуоресцеин и 1-черна дупка QuenH-QuQH и за GAPDH бяха смисъл 5′-GGGCATCTTGGGCTACACT-3 ′ и антисенс 5′-GGCATCGAAGGTGGAAGAGT-3 ′ със сондата 5′-AGGACCAGGTTGTCTCCTGCGA-3 ′, маркирана с CAL Fluoro Red 210 и CAL Fluoro Red 610. Реакциите бяха извършени, както е описано по-горе (21).

Western Blot, анализ за инсулиново сигнализиране и култура на яйчниците

Мишките на гладно през нощта се инжектират с обикновен човешки инсулин (1,5 единици/kg телесно тегло) или PBS. Яйчникът се събира 10 минути след инжектирането и се използва за отделяне на тека и гранулозната клетка (GC) (25) или за инкубация на целия яйчник. Накратко, за разделяне на тека и GC, яйчникът беше взет от бурсата и потопен в среда 5A на McCoy’s (Life Technologies, Grand Island, NY), снабдена с 25 mmol/L HEPES, 0.1% BSA и антибиотици (26). Яйчникът беше пробит ръчно с игла с размер 26 и пинсета с фин връх. GC се освобождават в средата и се центрофугират при 250 g в продължение на 5 минути при 4 ° C. Пелетите бяха замразени в течен азот. Останалите клетки на яйчника, считани за обогатени TI/стромални клетки, бяха центрофугирани за кратко и замразени в течен азот.

Измерването на протеиновите концентрации и Western blot анализ се извършват, както е описано по-горе (17). Накратко, 5 μg протеин от изолирани тека клетки от всеки отделен миши яйчник се зарежда върху гела за извършване на Western blot анализ. Използвани първични антитела бяха заешко поликлонално антитяло към фосфорилиран (p) AKT (Ser473) или към AKT, заешко моноклонално антитяло към IR-β (4B8; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), заешко моноклонално антитяло към цитохром P45017A1 (Cyp17; Abcam, Cambridge, MA), заешко поликлонално антитяло към LHR (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) и миши моноклонално антитяло към актинов клон C4 (EMD Millipore, Billerica, MA) pAKT и общата AKT също се измерват чрез Western blot или чрез Bio-Rad Bio-Plex Pro Assays в Luminex 200 (Austin, TX). Експресията на протеин на pTyr-IRS1 се измерва чрез комплекти pIRS1 Milliplex Map Phospho IRS1 Mapmates (EMD Millipore) в Luminex 200. Алтернативно, яйчникът се инкубира в 24-ямкова тъканна културна плака с вложки за кладене на тъканна култура (Millicell-CM, 0.4- μm размер на порите; EMD Millipore) (27,28) с 5A среда на McCoy's. Средата се събира след 3 часа инкубация (0 часа) и яйчникът се инкубира с прясна среда с 1,6 IU/ml човешки хорионгонадотропин (hCG). След това средата беше събрана 24 часа по-късно (24 часа).

Хистология и имунооцветяване

Яйчникът беше дисектиран от дистрофични мишки и фиксиран в 10% формалин фосфатен буфер и разделен на 5 μm дебелина изцяло от Johns Hopkins Medical Laboratories (хистологична група). Всяка 10-та секция беше събрана и овариалните секции бяха оцветени с хематоксилин и еозин. Жълтите тела (CL), преантралният фоликул и антралният фоликул бяха преброени и изследвани с микроскоп Zeiss. За имунооцветяването мишките бяха на гладно цяла нощ и им се инжектира 1,5 единици/kg BW инсулин. Яйчниците бяха събрани след 10 минути инжектиране и фиксирани в 4% параформалдехид. Всеки яйчник се замразява в среда с оптимална температура на рязане и се разделя на 5 μm. Секциите бяха инкубирани с първичен (pAkt [Ser473]; Cell Signaling Technology) и вторично антитяло кози анти-заешки IgG Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Eugene, OR), както е описано по-горе (21). Секции бяха заснети с камера AxioCamMR и експортирани в софтуера AxioVision.

Статистически анализ

Данните бяха анализирани чрез несдвоен тест на Student t с помощта на GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., Сан Диего, Калифорния), с изключение на случаите, когато е специално адресирано. Данните са изразени като средни стойности ± SEM.

Резултати

Поколение на мишки Cyp17IRKO