Изобретението се отнася до диетичен състав за диагностициране и управление на хранителни алергии при домашни животни като кучета и котки, и по-специално до хипоалергенен диетичен състав, който използва хидролизиран протеин като единствен протеинов източник.

хипоалергичен

Постоянно предизвикателство във ветеринарната общност е диагностицирането и управлението на хранителни алергии при домашни животни като кучета и котки. Хранителните алергии често водят до дермални и стомашно-чревни заболявания при кучета, които могат да развият хранителна свръхчувствителност на възраст от 2 месеца до над 12 години. Други симптоми, свързани с хранителни алергии при кучета, включват хронична диария, малабсорбция на хранителни вещества, загуба на тегло, коремна болка и летаргия.

Основните хранителни алергени са водоразтворимите гликопротеини с молекулно тегло от 10 000 до 60 000 далтона. Основните причини за хранителна свръхчувствителност при кучета са млечните продукти, говеждото и растителните протеини, докато котките развиват предимно хранителна свръхчувствителност към риба и млечни продукти.

Диагностиката на хранителни алергии при животни включва процедури като интрадермални кожни тестове с хранителни алергени или серологични тестове като радиоалергосорбент (RAST) или ензимно свързани имуноанализи (ELISA). Установено е обаче, че такива методи са ненадеждни. Понастоящем диагностиката на хранителни алергии обикновено изисква поставяне на животното на домашно приготвена елиминационна диета, която отнема много време и е неудобна. Например, животното трябва да бъде на елиминационна диета за периоди от 3 до 10 седмици.

Често лечение за свръхчувствителност към храната е стриктното избягване. Избягването обаче може да бъде трудно за постигане при домашни животни, тъй като диетите, приготвени в домашни условия, са неудобни за приготвяне, източниците на протеини като агнешкото може да се затруднят, а търговските диети могат да имат скрити антигени. В допълнение, продължителното хранене с един или повече нови източници на протеин може да доведе до развитие на свръхчувствителност към този протеин. Въпреки че кортикостероидите могат да намалят клиничните признаци, хроничната употреба може да има дългосрочни вредни ефекти върху кучета и котки.

Установено е, че алергенните свойства на протеините могат да бъдат намалени чрез ензимна хидролиза на протеини в пептиди. Проучванията показват, че диетите, формулирани с хидролизиран протеин, ще намалят антигенното натоварване и ще намалят алергичните реакции в моделите на хранителни алергии. Частично хидролизирани диети са били използвани за високорискови бебета и за предотвратяване на клинични признаци на хранителна свръхчувствителност при кучета и котки. По-голямата част от тези диети използват хидролизирани млечни продукти (казеин) или растителни протеини (соев протеин). Такива проучвания обаче не показват степента на хидролиза, необходима за предотвратяване на алергична реакция при животни. Също така предишните проучвания не показват подходящи източници на протеини за използване в диетата на домашни животни.

Друг фактор, който трябва да се вземе предвид при разработването на хипоалергенна диета за домашни животни, е включването на източник на фибри, което води до приемливо образуване на изпражнения, като същевременно се избягват всякакви потенциални алергии. Например, пулпата от цвекло е често използван източник на фибри в храни за животни, съдържащи протеини, които могат да предизвикат алергична реакция.

Съответно в областта все още има нужда от диетичен състав за домашни животни като кучета и котки, който позволява диагностицирането и управлението на хранителни алергии при такива животни, като същевременно осигурява приемливо образуване на изпражнения.

Настоящото изобретение отговаря на тази необходимост чрез осигуряване на хипоалергенен диетичен състав за домашни животни като котки и кучета, който може да се използва за диагностика и управление на хранителни алергии. Диетичният състав включва хидролизиран протеин като единствен източник на протеин в диетата за намаляване на производството на антиген и алергични реакции, заедно с източник на фибри, който осигурява приемливо образуване на изпражнения.

Съгласно един аспект на настоящото изобретение е осигурен хипоалергичен диетичен състав за домашни животни, съдържащ на база сухо вещество източник на протеин, източник на мазнини и източник на въглехидрати, където източникът на протеин се състои от около 20 до 30 тегловни% на база сухо вещество на хидролизиран протеин. Хидролизираният протеин за предпочитане включва хидролизиран пилешки дроб. За предпочитане, поне 99% от протеина има молекулно тегло под 1,5 kDa.

Източникът на въглехидрати е за предпочитане маниока, която съдържа от около 50 до 60 тегловни% на база сухо вещество от състава.

Съставът за предпочитане допълнително съдържа от около 1 до 5 тегловни% на база сухо вещество на източник на влакна, избран от групата, състояща се от ябълкови влакна, грахови влакна, смес от карбоксиметилцелулоза (CMC) и устойчиво нишесте и техни смеси.

Когато съставът от настоящото изобретение се прилага на домашни животни в количество и честота, подходящи за техните хранителни нужди, е установено, че животните проявяват намалено производство на антиген. Съставът от настоящото изобретение може също така да бъде използван за осигуряване на метод за диагностициране на хранителна алергия при придружаващо животно. Например, животно, което изпитва алергични симптоми, може да бъде поставено на диетата на настоящото изобретение за няколко седмици и ако симптомите бъдат облекчени, наличието на хранителна алергия се потвърждава и след това животното може да бъде хранено с различни протеинови източници, за да определи специфичен източник на алергия.

Съответно, характеристиката на настоящото изобретение е да осигури хипоалергенен диетичен състав и метод за диагностициране на хранителни алергии при домашни животни. Други характеристики и предимства на изобретението ще станат очевидни от следващото описание, придружаващите чертежи и приложените претенции.

Фиг. 1 е стълбовидна диаграма, показваща кожните реакции на кучета, хранени с различни хидролизирани диети, включително хипоалергенната диета от настоящото изобретение; и

Фиг. 2 е стълбовидна диаграма, показваща отговорите на стомашната лигавица на кучета, хранени с хидролизирани диети, показани на фиг. 1.

Хипоалергенният диетичен състав от настоящото изобретение осигурява подобрение спрямо наличните понастоящем диетични състави, тъй като съставът използва хидролизиран протеин като единствен протеинов източник, което осигурява ефективен метод за диагностициране на хранителни алергии при домашни животни. Освен това, съставът включва източник на фибри, който не предизвиква допълнителен потенциал за алергична реакция и който осигурява приемливо образуване на изпражнения.

Установихме, че диетичният състав на настоящото изобретение намалява производството на антиген в животното и се представя също толкова добре или по-добре от другите налични в търговската мрежа хипоалергенни диети по отношение на демонстрацията на реакция или степента на реакцията.

Диетичният състав може да бъде осигурен във всяка подходяща форма, стига да съдържа предпочитаната концентрация на хидролизиран протеин на база сухо вещество. Например, съставът може да бъде екструдиран и консервиран или предоставен под формата на бисквити.

Съставът за предпочитане съдържа от около 9% до 30% тегловни мазнини, 50 до 60% тегловни въглехидрати и от около 20 до 30% тегловни от хидролизирания протеинов източник, всички на база сухо вещество. В допълнение, съставът за предпочитане включва от около 1 до 5 тегловни% източник на влакна, избран от ябълкови влакна, грахови влакна, смес от карбоксиметилцелулоза и устойчиво нишесте и техни смеси.

Източникът на хидролизиран протеин в състава за предпочитане включва хидролизиран пилешки дроб. Съставът за предпочитане е формулиран така, че поне 99% от протеиновия източник да има молекулно тегло по-малко от 1,5 kDa, за да се гарантира, че е настъпила хидролиза до степен, която да предотврати алергична реакция.

Източникът на въглехидрати за предпочитане включва маниока, но може да включва и други източници като картофено брашно, овес и ечемик.

Източникът на мазнини за предпочитане включва животински мазнини, но може също да включва птичи мазнини, рибено масло, ленено масло и масло от пореч.

За да може по-лесно да се разбере изобретението, се прави позоваване на следните примери, които имат за цел да илюстрират изобретението, но не и да ограничават обхвата му.

За кучетата е формулирана диета, която използва хидролизиран пилешки дроб като източник на протеин и маниока като източник на въглехидрати. Диетата е формулирана с 99,8% от протеина с молекулно тегло под 1,4 килоДалтона (kDa), както е показано по-долу в Таблица 1.

От първоначалното проучване на вкуса беше установено, че трябва да се идентифицира източник на фибри с умерена ферментабилност в стомашно-чревния тракт на кучето, но който няма да причини алергична реакция и което би довело до приемливо образуване на изпражнения. Източниците на влакна, отговарящи на тези критерии, са ябълкови влакна, грахови влакна и комбинация от CMC/устойчиво нишесте. Тези влакна са включени в диети (виж таблица 4) и са тествани за производство на изпражнения в биологичен анализ. За това биологично изследване са използвани общо 12 кучета (4 кучета на лечение). Кучетата са хранени със съответните си диети в продължение на 21 дни и резултатите от фекалиите се записват ежедневно. Резултатите са обобщени в Таблица 5. Диетата, формулирана с Apple Pomace, доведе до най-добре оформените изпражнения.

Диетата от пример 1 беше тествана, за да се определи нейната ефикасност. Използваната диета е представена в Таблица 6 по-долу.

Протокол. Изследванията са проведени в съответствие с NIH Ръководство за грижа и употреба на лабораторни животни и Канадския съвет по животните Ръководство за грижа за грижите и използването на опитни животни. За това проучване са използвани кръстосани кучета шейни (n = 14) и животните са получени от 3 котила. Животните бяха разпределени на случаен принцип в 2 групи за лечение в рамките на 24 часа след раждането. Кучета от група 1 (n = 11) са сенсибилизирани към казеин, пилешки черен дроб и соев протеин, а кучетата от група 2 (n = 3) действат като контроли и не са чувствителни към хранителни антигени.

Кучетата бяха поставени на диета за кученца (The Iams Company, Дейтън, Охайо) през първите 6 месеца и след това се поддържаха на диета за възрастни (The Iams Company, Дейтън, Охайо) през останалата част от проучването. Тези диети не съдържат млечен протеин, соев протеин или пилешки дроб. Кучетата получиха диети, съдържащи млечен протеин, соев протеин и пилешки дроб в продължение на 4 седмици на 11-месечна възраст. Храната се предоставя съгласно препоръките на производителите, а прясна вода се предоставя по желание. Животните са наблюдавани ежедневно и са регистрирани всякакви клинични отклонения.

Хранителни антигени/анализ. Сенсибилизиращите антигени включват казеин, соев протеин и пилешки дроб (1: 1: 1, в зависимост от теглото). Реакциите на свръхчувствителност бяха проведени при следните хидролизирани и непокътнати диети: казеин (Sigma), 1% хидролизиран казеин (Iams), 2% хидролизиран казеин (Iams), 5% хидролизиран казеин (Iams), 10% хидролизиран казеин (Iams), 20 % хидролизиран казеин (Iams), 50% хидролизиран казеин (Iams), пилешки черен дроб, хидролизиран пилешки дроб (Iams), соев протеин, Exclude® (хидролизиран казеин и черен дроб, 16.5% протеин, DVM Pharmaceuticals, Маями, Флорида), HA -Formula ™ (хидролизирана соя, 18% протеин, Ralston Purina, St. Louis, Mo.) и диета с хидролизиран пилешки дроб (тестова диета; 19% протеин, The Iams Company, Lewisburg, Ohio). Хидролизата на казеин и пилешки дроб се извършва от Iams Company (Lewisburg, Ohio). Степента на хидролиза, изразена като процент, представлява съотношението на реакцията на хидролиза към свободни аминокиселини.

За да се определят молекулните тегла на протеините в тестовите диети и сенсибилизиращите антигени, беше проведена SDS-PAGE електрофореза. Всеки антиген се приготвя чрез получаване на 10% тегл./Тегл. суспензия или разтвор с използване на дестилирана вода и енергично разклащане в продължение на 1 час. Концентрацията на протеин се определя с помощта на системата за анализ BioRad (BioRad, Missisauga Ontario). Разтворите се коригират така, че да съдържат 2 mg/ml протеин. SDS-PAGE електрофорезата се извършва върху 20% отделящ гел и 4% подреждащ гел при 200V за 5,5 часа. Десет микрограма протеин бяха заредени във всяка лента на гела.

SDS-PAGE геловете разделят протеини между 5 и 80 kDa. Откриваемото максимално и минимално молекулно тегло от всяка проба е дадено в таблица 7.

В пробите от 1%, 2% и 5% хидролизиран казеин се получава минимална хидролиза на високомолекулни протеини. Тези хидролизирани проби не се различават съществено само от казеин. Постигната е значителна хидролиза на високомолекулни протеини в 10 и 20% проби, но все още има доказателства за някои високомолекулни протеини. Специфични казеинови протеини като α-лакталбумин (14,2 kDa) могат да бъдат идентифицирани в 1-10% хидролизирани проби от казеин. Пълна хидролиза на високомолекулни протеини изглежда е постигната в 50% хидролизирана проба от казеин. Нехидролизираният казеин има изобилие от високомолекулни протеини. Както пилешкият черен дроб, така и хидролизираният пилешки дроб имат ленти с високо молекулно тегло. Постигната е значителна хидролиза на протеини в диетите Exclude, HA-Formula и теста, но все още могат да бъдат идентифицирани слаби ленти с високо молекулно тегло.

Протокол за сенсибилизация. Протоколът за сенсибилизация за кучета от група 1 включва подкожно инжектиране на кученца с жива вирусна ваксина (чума, хепатит, парвовирус, параинфлуенца, Fort Dodge Ayerst, Guelph Ontario), последвано от подкожно инжектиране на хранителен антиген в адювант на стипца 10. Между ден 1 и ден 85, кучета от група 1 бяха сенсибилизирани чрез 7 инжекции от 1 mg казеин, соев протеин и пилешки черен дроб. Контролните животни са получавали само адювант.

Кожни тестове. Проведени са кожни тестове, след като кучетата са изпълнили протокола за сенсибилизация към сенсибилизиращите антигени на приблизително 6-месечна възраст. Дермална свръхчувствителност към тестовите диети (казеин, 1% хидролизиран казеин, 2% хидролизиран казеин, 5% хидролизиран казеин, 10% хидролизиран казеин, 20% хидролизиран казеин, 50% хидролизиран казеин, пилешки черен дроб, хидролизиран пилешки черен дроб, соев протеин, Изключете, HA-Formula, тестова диета) са проведени на приблизително 10-месечна възраст. Вентралният аспект на корема е използван за тестване на кожата на всяко кученце. Четири концентрации хранителен алерген (2000, 200, 20 и 0,02 μg/ml) се инжектират интрадермално (0,05 ml). Хистаминът в същата концентрация като антигените се използва като положителна контрола, докато стерилен физиологичен разтвор се използва като отрицателна контрола. Синьото багрило Evans (0,5%, 0,2 ml/kg) се прилага интравенозно 5–10 минути след интрадермалните инжекции. Приблизително 20 минути след интрадермалните инжекции се измерва диаметърът на реакцията на пшеницата и изгарянето на всеки алерген.

Гастроскопична хранителна чувствителност. Проведени са гастроскопски изследвания на кученца, когато са били на възраст приблизително 6 месеца (след сенсибилизация) и 10 месеца (тестови диети). Кучетата бяха анестезирани с 2-3% халотан след седация с ацепромазин. Ендоскопията е извършена с педиатричен горен GI ендоскоп с работещ канал за инжекции. Тестовите антигени (същите като кожните тестове, 0,5 ml, 1 mg/ml в 1: 1 физиологичен разтвор/глицерин) се инжектират в стомашната лигавица с помощта на игла за склеротерапия. Контролата се състоеше от физиологичен разтвор/глицерин. Синьото багрило Evans (0,5%, 0,2 ml/kg) се прилага IV 5–10 минути преди стомашните инжекции. Отговорите на стомашната лигавица към всеки антиген и контрола се оценяват 5 минути след инжектирането според степента на подуване, еритема и синьото кръпка, като се използва следната система за класификация: 0 = нормална стомашна лигавица; 1 = лек еритем; 2 = лек еритем и оток; 3 = умерен еритем и оток; леко синьо закърпване; 4 = тежък еритем и оток; синьо закърпване.

Серумен IgE. В края на протокола за сенсибилизация (на възраст 6 месеца) се събира серум от контролни и сенсибилизирани кучета. Концентрацията на специфични IgE серумни антитела се определя с помощта на ELISA в търговска диагностична лаборатория (Biomedical Services, Austin, Texas). Титърът на серумния IgE е сравнен с голям набор от нормални кучета и кучета с установена свръхчувствителност към храната. Нивата на IgE бяха оценени като нормални, гранични, положителни и силно положителни.

Сенсибилизация на кучета. След като кучетата са преминали през протокола за сенсибилизация, чувствителността на кожата и стомашните реакции към сенсибилизиращите антигени са измерени на 6-месечна възраст. Беше установено, че всички кучета са успешно чувствителни към казеина, соевото брашно и антигените на пилешкия черен дроб. Контролните животни не са сенсибилизирани.

Клинична оценка. Когато кучетата са били поставяни на диети, състоящи се от соя, казеин и пилешки дроб на 11-месечна възраст, всички сенсибилизирани кучета развиват умерена до няколко диария и отслабват (данните не са показани). Освен това 8 от 11 сенсибилизирани кучета демонстрират дерматологични реакции, които включват загуба на коса и сърбеж на вентрала. Не са наблюдавани дерматологични реакции при контролните кучета. Клиничните признаци се развиват през първата седмица от храненето на сенсибилизиращата диета и продължават, докато е била предвидена диетата.

Моделите на стомашно-лигавичните реакции към тестовите диетични антигени са подобни на тези, наблюдавани след дермалните инжекции. При сенсибилизираните кучета само 50% хидролизиран казеин, HA-формула, Exclude и тестова диета имат гастроскопски резултати значително по-ниски от нехидролизираните антигени (ФИГ. 2). Тестовата диета беше най-слабо реактивната от всички предизвикателни антигени. Гастроскопските резултати на контролните кучета са нормални или незначителни за всички антигени (ФИГ. 2).

Резултати. Резултатите от проучването показват, че е необходима висока степен на протеинова хидролиза (до 50% от пълната хидролиза) за елиминиране на реакциите на свръхчувствителност. По-малка степен на хидролиза може да засили алергичните реакции, тъй като антигенните епитопи в триизмерната структура на протеините са изложени на имунологична обработка.

Кучетата не отговориха на търговските хипоалергенни хидролизирани диети (Exclude или HA-Formula diet), които са съответно на млечни/чернодробни и соеви формули. Тестовата диета осигури най-малко кожни и лигавични реакции от трите сенсибилизирани диети.

Докато някои примерни изпълнения и подробности са показани за целите на илюстрирането на изобретението, ще бъде очевидно за специалистите в областта, че могат да бъдат направени различни промени в методите и апаратурата, разкрити тук, без да се излиза от обхвата на изобретението, което е дефинирани в приложените претенции.