Тази статия има корекция. Моля виж:

Резюме

Въведение

Диабетът е патологично състояние на нарушена глюкозна хомеостаза, характеризиращо се с абсолютен или относителен дефицит на инсулин и загуба на β-клетки, произвеждащи инсулин. При диабет тип 2 (T2D) β-клетъчната недостатъчност е резултат от многофакторен процес, иницииран от инсулинова резистентност, често в условията на затлъстяване (1–3). При T2D разнообразни обиди допринасят за прогресивна β-клетъчна недостатъчност, включително ендоплазмен стрес ретикулум, възпалителни цитокини, излишък на реактивни кислородни видове и гликолипидна токсичност (2). Загубата на β-клетки се случва чрез комбинация от повишена апоптоза и дедиференциация, въпреки че относителният принос на тези резултати остава неясен (3–6). Понастоящем основна изследователска цел е да се разберат молекулярните механизми на β-клетъчната недостатъчност и да се разработят стратегии за обръщане на този процес.

нарушаване

Въпреки че T2D се придружава от намалена секреция на инсулин в края на заболяването, повишената секреция на инсулин е ранна адаптация към инсулиновата резистентност (7,8). Трябва да се отбележи, че индивиди без диабет с висок генетичен риск за диабет имат намален глюкозо-стимулиран инсулинов отговор (9), но дали това е следствие от дефектна функция на β-клетките или дефицитна β-клетъчна маса не е ясно. Свързаните с T2D алели на риска включват гени, които участват и в двата процеса (напр. CDKN2A, KCNQ1 [10–12]). Проучванията с миши демонстрират централна роля за пластичността на β-клетъчната маса в приспособяването на свързаната със затлъстяването инсулинова резистентност (13). Въпреки че адаптивното разширяване на β-клетките е по-малко очевидно при хората, хората със затлъстяване без диабет имат 1,5-кратно увеличение на β-клетъчната маса и увеличен β-клетъчен брой (14). Следователно, човешката β-клетъчна маса вероятно проявява умерена пластичност, която влияе върху чувствителността на индивида към T2D (15).

Изследователски дизайн и методи

Генериране, генотипиране и хранене на ADK-насочени мишки

Условно нарушаване на експресията на гена ADK. A: Схематично представяне на Adk локус и конструктивна конструкция: мутагенна ориентация (ADK 1), Flp рекомбиназа-зависима немутагенна ориентация (ADK 2) и Cre рекомбиназа-зависима мутагенна ориентация (ADK 3). Показани са преден праймер (Fwd), обратен праймер (Rev), B32 праймер, рекомбинационни последователности (Frt и LoxP), SA и β-галактозидаза/βgeo. Б: Хистохимично оцветяване на участъци на панкреаса от мишки, насочени към Adk за активност на β-галактозидаза (синьо); са показани оцветяване с еозин (розов, горен ред) или инсулин (кафяв, долен ред). C: насочено към ADK Western blot на чернодробни тъканни лизати от насочени към Adk и контролни мишки. Неспецифичната горна лента отразява натоварването на пробата (контрол на натоварването [LC]). D: Чернодробни и островни лизати, изследвани за ADK и енолаза (LC).

Западно петно

За SDS-PAGE бяха използвани изолирани островчета и хомогенизирани лизати на чернодробната тъкан (RIPA Lysis System, sc-24948; Santa Cruz Biotechnology). Нарушаването на ADK, ограничено от островчета, се оценява чрез използване на чернодробни и островни лизати от възрастни βADKO и контролни животни. Островчета са изолирани, както е описано по-рано (20). За откриване на протеини са използвани Anti-ADK (1: 200, sc-32908) и анти-енолаза (1: 500, sc-15343).

Експерименти с физиология на глюкозата

Всички експерименти с физиологията на глюкозата бяха извършени върху кохорти, съвпадащи по възраст и пол. Измерванията на глюкозата бяха направени в посочените часове с TRUEresult глюкомер и TRUEtest ленти. За измерване на глюкозата на гладно и интраперитонеално тестване на глюкозен толеранс (IPGTT), мишките се претеглят и гладуват цяла нощ (14 часа, 18:00 ч. - 8:00 ч. Сутринта). Нивата на глюкоза са получени на 0 минути преди инжектиране на глюкоза 1,5–2,0 g/kg i.p. (10 μL/g) и в следващите посочени моменти от време. Случайни нива на глюкоза са получени за хранени мишки в 10:00 ч. Извършено е интраперитонеално тестване на инсулинов толеранс (IPITT), като се използват 0,5–1,5 единици/kg хумулин (R-100; Eli Lilly), както е посочено след 4-часово бързо започване в 8: 00 ч. In vivo глюкозно-стимулирана секреция на инсулин (GSIS) беше измерена в кръв, събрана от гладуващи през нощта мишки в момент 0 и след инжектиране на глюкоза 3 g/kg ip Инсулинът се измерва с Alpco Mouse свръхчувствителни инсулинови ELISA комплекти (80-INSMSU-E01). ADK 2/+ Rip-Cre животни не показват откриваем фенотип и бяха включени в ADK +/+ Rip-Cre като контролни животни.

Хистология

In vitro репликация на β-клетки

Островчета бяха изолирани от 36-седмични инжектирани с носител (n = 4) и инжектирани с тамоксифен (n = 4) iβADKO мишки. Инжекциите се извършват на възраст 18 седмици, за да се избегне въздействие върху развитието, а островчетата се събират след 18-седмично закъснение, за да се избегнат потенциални краткосрочни ефекти на тамоксифен и рекомбинация. Островчетата бяха разпръснати, посяти (оставени да се прикрепят 60 часа), третирани (с продължителност 60 часа), фиксирани и анализирани (оцветяване с PDX-1 и ki67), както е описано по-рано (19,20).

Статистика

Експерименталните данни са представени като разпръснати графики със съседно представяне на статистическата средна стойност, която включва лента за грешка, представяща SD. Статистически значимите разлики бяха определени чрез използване на двустранен t тест на Student, където P ≤ 0,05 беше прието да бъде значимо. Експерименталните резултати са потвърдени при независими експерименти във всички случаи, с изключение на експериментите за репликация на in vivo β-клетки.

Резултати

Модел на мишката, насочен към Adk

За да изследваме in vivo функцията на ADK в β-клетки, генерирахме мишки, условно насочени към локуса на Adk (Фиг. 1А). Интегрираната мутагенна ориентация (ADK 1) постави високоефективна сплайсинг-акцепторна последователност (SA)/βgeo експресионна касета (β-галактозидаза-неомицин резистентен ген за сливане) в рамка с екзони 1a и 1b, ADK транскрипционните стартови сайтове, които кодират ADK- къси (цитоплазматични) и ADK-дълги (ядрени) изоформи, съответно (28). Активността на β-галактозидаза се използва за оценка на експресията на ADK в панкреаса на мишки Adk 1/+ (фиг. 1В, леви панели). ADK е силно експресиран в екзокринния панкреас и умерено експресиран в ендокринния панкреас, където преобладава ядрената изоформа (ADK-long). Новородените котила от хетерозиготни (Adk 1/+ × Adk 1/+) гнездови двойки съдържат Adk 1/+ малки на честота по Мендел. Въпреки това, в съответствие с публикувания фенотип на ADK-нулеви животни, при отбиването не са идентифицирани ADK 1/1 мишки (> 150 мишки, скринирани) (29). Освен това ADK протеинът е почти неоткриваем в хепатоцитните лизати от Adk 1/1 новородени малки (фиг. 1С). Тези резултати показват ефективно нарушаване на експресията на ADK от стратегията за насочване.

Ние нарушихме експресията на ADK в β-клетки (βADKO мишки), като използвахме Rip-Cre драйвер щам (30). Потвърдихме нарушаването на β-клетките чрез измерване на активността на β-галактозидазата в участъци от панкреатична тъкан от 1) мишки, приютяващи вектора на генния капан в немутагенна ориентация (мишки Adk 2/+), 2) мишки Rip-Cre и 3) Rip-Cre Adk 2/+ мишки (βADKO-Het) (Фиг. 1В). Както се очакваше, на панкреатичните участъци от Adk 2/+ и Rip-Cre животни липсваше активност на β-галактозидаза, докато βADKO-Het секциите показват β-клетъчно ограничена активност на β-галактозидаза. За отбелязване е, че Rip-Cre мишките имат рекомбинационна активност в мозъка и проявяват непоносимост към глюкоза (31,32). Следователно, всички изследвания включват Rip-Cre контролни животни. След това оценихме разрушаването на ADK чрез Western blot на чернодробни и островни лизати от мишки Rip-Cre, βADKO-Het и βADKO (фиг. 1D). Докато експресията на ADK в черния дроб е подобна сред генотиповете, експресията на ADK на островчетата е намалена при βADKO животни. Остатъчната експресия на ADK в пробите на островчета може да отразява екзокринно и/или инсулино-отрицателно замърсяване на островни клетки. Взети заедно, тези данни показват успешно нарушаване на експресията на ADK в β-клетките на панкреаса.

βADKO мишките са защитени срещу HFD-индуцирана глюкозна непоносимост

Младите βADKO животни са по-тежки от Rip-Cre контролните кученца (фиг. 2А). На 8-седмична възраст женските мишки βADKO тежат ∼2 g повече от контролните животни на Rip-Cre (18,3 ± 0,3 срещу 16,1 ± 0,6 g; P 0,05). Към 52 седмици телесното тегло на Rip-Cre (28,9 ± 1,4 g) и βADKO (29,2 ± 1,5 g) е неразличимо. 13-седмични мишки с βADKO и Rip-Cre, хранени с HFD, демонстрират повишено повишаване на теглото в сравнение с генетично съвпадащи NC-хранени мишки, започващи 2 седмици след започване на HFD (P 0,05 във всеки момент от времето) (фиг. 2В). По този начин, βADKO животните са преходно по-тежки от контролните животни, но не са предразположени към повишено HFD-индуцирано наддаване на тегло.

Оценихме въздействието на индуцираното от тамоксифен β-клетъчно специфично нарушение на ADK върху глюкозната хомеостаза и репликацията на β-клетки при зрели животни (Фиг. 5А). Тамоксифен-зависимото нарушаване на експресията на ADK се потвърждава чрез индукция на активността на β-галактозидаза (Фиг. 5В). Подобно на βADKO мишки, хранени с NC, третирани с NC вехикулум и тамоксифен iβADKO мишки демонстрират сравними IPGTTs (фиг. 5С). Следователно, лечението с тамоксифен не е оказало влияние върху IPGTT. Също така в съответствие с фенотипа βADKO, мишките, лекувани с HFD, лекувани с тамоксифен, демонстрират значително по-ниски стойности на захранената глюкоза (фиг. 5D) и подобрен IPGTT след 3 (фиг. 5Е) и 11 (фиг. 5F) седмици от HFD. За разлика от това, инсулиновата чувствителност, измерена чрез IPITT, е непроменена (фиг. 5G), може би показващо въздействие на ектопичната рекомбиназна активност при βADKO мишки. И накрая, оценихме дали нарушаването на ADK засили in vivo GSIS. В действителност, мишките, лекувани с тамоксифен, демонстрират повишена секреция на инсулин след предизвикване на глюкоза (15-минутно лечение с носител 0,15 ± 0,02 спрямо лечение с тамоксифен 0,24 ± 0,04 ng/ml; P = 0,01) (Фиг. 5Н). Тези данни показват, че β-клетъчно-специфичното нарушаване на ADK при възрастни мишки е било защитно срещу HFD-индуцирана глюкозна непоносимост и подобрен GSIS in vivo.