РЕЗЮМЕ

Въведение

Поради богатата еволюционна история и настоящото екологично разнообразие на телеостните риби, изследването на тази група е особено информативно при изясняване на реакциите на животните към хипоксия (Nikinmaa and Rees, 2005). Тези отговори включват поведение за избягване на хипоксични зони, използване на добре аерирана микросреда или намаляване на активността (Kramer, 1987; Van den Thillart et al., 1994; Dalla Via et al., 1998; Wannamaker and Rice, 2000); физиологични и морфологични корекции, които подобряват извличането и доставянето на кислород до тъканите (Jensen et al., 1993; Sollid et al., 2003); и биохимични промени, които увеличават способността на тъканите да функционират и оцеляват при ниско съдържание на кислород (Hochachka, 1980; Van den Thillart и Van Waarde, 1985; Hochachka and Somero, 2002). Като цяло този набор от отговори служи за компенсиране на намаляването на наличността на кислород в околната среда и води до толерантност към хипоксия, която при някои видове е доста изразена.

въглехидратния

Един биохимичен отговор на хипоксия е увеличаване на анаеробното производство на АТФ, обикновено чрез гликолиза (Van den Thillart и Van Waarde, 1985; Dalla Via et al., 1994; Virani and Rees, 2000). Редица проучвания показват, че хипоксичната експозиция увеличава дейностите на гликолитичните ензими, които вероятно увеличават капацитета на рибните тъкани за производство на анаеробна енергия (Greaney et al., 1980; Johnston and Bernard, 1982; Van den Thillart and Smit, 1984; Dickson and Graham, 1986; Lushchak et al., 1998; Zhou et al., 2000; Kraemer and Schulte, 2004). Тези увеличения обаче не са наблюдавани еднакво сред гликолитичните ензими, в тъканите или сред видовете. Например, хипоксичното излагане на килифи, лини и златни рибки доведе до повишена активност на някои гликолитични ензими в черния дроб, но не и в белите скелетни мускули (Greaney et al., 1980; Johnston and Bernard, 1982; Van den Thillart and Smit, 1984 ). Обратната тенденция, повишена ензимна активност в мускулите и липса на промени в черния дроб, се наблюдава при Hoplias microlepis (Dickson and Graham, 1986). В тъканите на други видове ензимните дейности остават същите (Shaklee et al., 1977; Driedzic et al., 1985) или намаляват по време на хипоксично излагане (Almeida-Val et al., 1995). В допълнение, всички с изключение на едно от горепосочените проучвания отчитат данни само за подгрупа от ензимите на гликолиза (само един или два). Единичното проучване, което измерва всички гликолитични ензими, го прави само в една тъкан, черен дроб и установява повишена активност на ензими, катализиращи реакции, близки до равновесие, но не и за тези, катализиращи реакции, далеч от равновесието (Kraemer and Schulte, 2004).

Тези измервания ни позволиха да отговорим на следните въпроси относно ефектите на хроничната хипоксия върху метаболитния потенциал на различни тъкани при F. grandis. Различните тъкани реагират ли подобно на хипоксична експозиция? Всички ензими в рамките на даден път (гликолиза) се променят съвместно (т.е. в една и съща посока и със същата величина)? И накрая, в една тъкан (черен дроб) способностите за катаболни и анаболни процеси реагират по подобен или различен начин на хроничната хипоксия? Резултатите показват, че когато непокътнатите риби се аклиматизират към продължителна хипоксия, ензимните действия реагират по специфичен за тъканите начин и че в тъканта промените в ензимните дейности не са равномерно разпределени по метаболитен път.

Материали и методи

Животни

Рибите са хранени до насищане със замразени саламурени скариди (Artemia spp., Марка на залива на Сан Франциско, Нюарк, Калифорния, САЩ), Prime Tropical Flakes (Ziegler Brothers, Inc., Gardners, PA, USA) и солени скариди науплии (OSI, Snowville, UT, САЩ) два пъти дневно. Диетата беше променена на скариди от жива трева (Palaemonetes spp.) След 2 седмици. В началото на експозицията рибите при двете лечения бяха еквивалентни по стандартна дължина (нормоксия, 80,7 ± 6,7 mm; хипоксия 79,9 ± 4,6 mm) и маса (нормоксия, 10,8 ± 3,2 g; хипоксия 10,0 ± 2,3 g). И двете групи нарастват през 4-седмичното излагане, въпреки че нормоксичните риби растат повече от хипоксичните (C. A. Landry, S. L. Steele, S. Manning и A. O. Cheek, ръкопис, изпратен за публикуване). Следователно нормоксичните риби са по-дълги (нормоксия, 84,8 ± 6,9 mm; хипоксия, 80,7 ± 5,3 mm; P≤0,05) и по-тежки (нормоксия, 15,2 ± 3,6 g; хипоксия, 11,7 ± 2,3 g; P≤0,01) от хипоксичните риби при края на експеримента.

Приготвяне на екстракт

След 4 седмици на излагане на нормоксия или хипоксия, рибите се свързват в мрежа и се убиват с предозиране на буфериран MS-222 (1 g MS-222 и 4 g NaHCO3 на литър вода). Черният дроб, мозъкът, сърцето и белите скелетни мускули се дисектират, замразяват се в течен азот и се съхраняват при -80 ° C до анализ. Взети са проби от скелетни мускули дорзално до страничната линия, за да се избегне червения мускул, и между главата и гръбната перка, за да се избегнат надлъжни вариации в ензимната активност (Martínez et al., 2000).

За гликолитични и глюконеогенни ензимни анализи тъканите се претеглят и хомогенизират в ледено студен буфер, състоящ се от 100 mmol l -1 Hepes (pH 7,4), 10 mmol l -1 KCl, 0,1 mmol l -1 DTT и 0,2% Triton X-100 (Pierce and Crawford, 1997) с хомогенизатор PRO 200 (PRO Scientific Inc., Кънектикът, САЩ) за два периода от 20 s. Пробите се държат на лед по време и между периодите на хомогенизиране. Проби от мускули, черен дроб и мозък се хомогенизират в девет обема буфер; сърцата се хомогенизират в 49 обема буфер. Хомогенатите се центрофугират при 2400 ж в продължение на 15 минути при 4 ° С и супернатантните разтвори се държат върху лед, докато се изследва ензимната активност.

Бяха направени отделни хомогенати за анализи на гликоген синтаза и гликоген фосфорилаза. За тях черният дроб и белите мускули бяха претеглени и хомогенизирани в четири обема ледено студен буфер, съдържащ 50 mmol l -1 имидазол, pH 7.5, 100 mmol l -1 NaF, 5 mmol l -1 EDTA, 5 mmol l -1 EGTA, 15 mmol 1 -1 β-меркаптоетанол и 0,1 mmol 1 -1 фенилметилсулфонил флуорид (PMSF) (Milligan, 2003). Пробите се хомогенизират с PRO 200 хомогенизатор за два периода от 20 s, докато се държат на студено. Тези хомогенати се центрофугират при 16 000 ж в продължение на 2 минути при 4 ° С и супернатантите се държат върху лед, докато се изследва ензимната активност.

Ензимни анализи

Реакционните условия за определяне на гликолитичните ензимни активности бяха модифицирани от Pierce and Crawford (Pierce and Crawford, 1994). За всеки ензим във всяка тъкан, концентрациите на субстрати, кофактори и свързващи ензими бяха оптимизирани, за да дадат максимални активности. Реакциите се инициират чрез добавяне на субстрата, специфичен за този ензим (показан последен за всяка реакция). Крайните условия на реакцията са както следва.

Хексокиназа (HK; EC 2.7.1.1): 100 mmol l -1 Hepes (pH 7.4), 10 mmol l -1 KCl, 7.5 mmol l -1 MgCl2, 3.1 mmol l -1 ATP, 1 mmol l -1 NADP, 10 mmol l -1 креатин фосфат, 2 iu ml -1 креатин киназа, 1 i.u. ml -1 глюкоза-6-фосфат дехидрогеназа и 7,5 mmol l -1 глюкоза. При тези условия глюкокиназата (хексокиназа тип IV) допринася за скоростите, измерени в чернодробната тъкан.

Фосфоглюкоизомераза (ЗГУ; EC 5.3.1.9): 100 mmol l -1 Hepes (pH 7.4), 10 mmol l -1 KCl, 1.25 mmol l -1 NADP, 0.5 i.u. ml -1 глюкозо-6-фосфат дехидрогеназа и 2 mmol l -1 фруктоза 6-фосфат.

Фосфофруктокиназа (PFK; EC 2.7.1.11): 100 mmol l -1 Hepes (pH 8.2), 10 mmol l -1 KCl, 7.5 mmol l -1 MgCl2, 1.25 mmol l -1 ATP (черен дроб, мозък, сърце) или 2.5 mmol l -1 ATP (мускул), 5 mmol l -1 AMP, 0.2 mmol l -1 NADH, 1 iu ml -1 алдолаза, 10 i.u. ml -1 глицерол-3-фосфат дехидрогеназа, 29 i.u. ml -1 триоза фосфат изомераза и 5 mmol l -1 фруктоза 6-фосфат (черен дроб, мозък, сърце) или 10 mmol l -1 фруктоза 6-фосфат (мускули).

Алдолаза (ALD; EC 4.1.2.13): 100 mmol l -1 Hepes (pH 7.4), 10 mmol l -1 KCl, 0.2 mmol l -1 NADH, 5 i.u. ml -1 глицерол-3-фосфат дехидрогеназа, 14,5 i.u. ml -1 триоза фосфат изомераза и 0,75 mmol l -1 фруктоза 1,6-бисфосфат.

Триозна фосфатна изомераза (TPI; EC 5.3.1.1): 100 mmol l -1 Hepes (pH 7.4), 10 mmol l -1 KCl, 0.2 mmol l -1 NADH, 10 i.u. ml -1 глицерол-3-фосфат дехидрогеназа (мускули, черен дроб, сърце) или 20 i.u. ml -1 глицерол-3-фосфат дехидрогеназа (мозък) и 2,9 mmol l -1 глицералдехид 3-фосфат (мускули, черен дроб, мозък) или 5,8 mmol l -1 глицералдехид 3-фосфат (сърце).

Глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH; EC 1.2.1.12): 100 mmol l -1 Hepes (pH 7.4), 10 mmol l -1 KCl, 2 mmol l -1 MgCl2 (мускули, мозък, сърце) или 1 mmol l -1 MgCl2 (черен дроб), 3,1 mmol l -1 ATP (мускул, мозък, сърце) или 1,55 mmol l -1 ATP (черен дроб), 0,2 mmol l -1 NADH, 8 iu ml -1 фосфоглицерокиназа и 2,8 mmol l -1 3-фосфоглицерат.

Фосфоглицерокиназа (PGK; EC 2.7.2.3): 100 mmol l -1 Hepes (pH 7.4), 10 mmol l -1 KCl, 10 mmol l -1 MgCl2, 3.1 mmol l -1 ATP (черен дроб, мозък, сърце) или 6.2 mmol l -1 ATP (мускул), 0.2 mmol l -1 NADH, 8 iu ml -1 глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа и 2,8 mmol l -1 3-фосфоглицерат.

Фосфоглицеромутаза (PGM; EC 2.7.5.3): За черния дроб, мозъка и сърцето анализът включва 100 mmol l -1 Hepes (pH 7.4), 10 mmol l -1 KCl, 5 mmol l -1 MgCl2, 0.65 mmol l -1 ADP, 0,125 mmol l -1 2,3-бисфосфоглицерат, 0,22 mmol l -1 NADH, 9 mmol l -1 глюкоза, 0,1 iu ml -1 енолаза, 0,5 i.u. ml -1 пируват киназа, 0,75 i.u. ml -1 l -лактат дехидрогеназа, 3,2 i.u. ml -1 хексокиназа и 1,25 mmol l -1 3-фосфоглицерат. За мускулите са използвани горните условия с изключение на MgCl2 е 2,5 mmol l -1, ADP е 1,25 mmol l -1, 2,3-бисфосфоглицерат е 62,5 μmol l -1 и глюкозата е 5 mmol l -1 .

Енолаза (ENO; EC 4.2.1.11): 100 mmol l -1 Hepes (pH 7.4), 10 mmol l -1 KCl, 2.5 mmol l -1 MgCl2, 1.3 mmol l -1 ADP (мускули, черен дроб, мозък) или 0.65 mmol l -1 ADP (сърце), 0,2 mmol l -1 NADH, 4,5 mmol l -1 глюкоза, 0,6 iu ml -1 пируват киназа, 0,75 i.u. ml -1 l -лактат дехидрогеназа, 1.6 i.u. ml -1 хексокиназа (мускули, черен дроб, мозък) или 3,2 i.u. ml -1 (сърце) и 1,25 mmol l -1 2-фосфоглицерат.

Пируват киназа (PYK; EC 2.7.1.40): 100 mmol l -1 Hepes (pH 7.4), 10 mmol l -1 KCl, 10 mmol l -1 MgCl2 (мускули и черен дроб) или 5 mmol l -1 MgCl2 (мозък и сърце), 7,6 mmol l -1 ADP (мускули и черен дроб) или 3,8 mmol l -1 ADP (мозък и сърце), 0,2 mmol l -1 NADH, 1,5 iu ml -1 l -лактат дехидрогеназа (мускул), 0,375 i.u. ml -1 l -лактат дехидрогеназа (черен дроб и сърце), или 0,75 i.u. ml -1 l -лактат дехидрогеназа (мозък) и 1 mmol l -1 фосфоенолпируват (мускул, черен дроб, мозък) или 2 mmol l -1 фосфоенолпируват (сърце).

Лактат дехидрогеназа (LDH; EC 1.1.1.27): 100 mmol l -1 Hepes (pH 7.4), 10 mmol l -1 KCl, 0.17 mmol l -1 NADH, 1 mmol l -1 пируват.

Условията за анализ на ензимите на метаболизма на гликоген са модифицирани от Milligan (Milligan, 2003).

Гликоген синтаза (GSase; EC 2.4.1.11): 50 mmol l -1 Tris (pH 7,8), 70 mmol l -1 KCl, 4 mmol l -1 MgCl2, 0,5 mmol l -1 фосфоенолпируват, 0,2 mmol l -1 NADH, 5 ю ml -1 l -лактат дехидрогеназа, 5 i.u. ml -1 пируват киназа, 2 mg ml -1 гликоген (стриден мускул, диализиран) и 2 mmol l -1 UDP-глюкоза. Общата активност на GSase се анализира в присъствието на 5 mmol 1 -1 глюкоза 6-фосфат. Активната GSase е измерена без глюкоза 6-фосфат.

Гликоген фосфорилаза (GPase; EC 2.4.1.1): 50 mmol l -1 калиев фосфат (pH 7,3), 15 mmol l -1 MgSO4, 0,5 mmol l -1 DTT, 0,5 mmol l -1 NADP, 0,25 mmol l -1 EDTA, 1 iu ml -1 глюкозо-6-фосфат дехидрогеназа, 1 i.u. ml -1 фосфоглюкомутаза, 0,01 mmol l -1 глюкоза 1,6-бисфосфат и 2 mg ml -1 гликоген (стриден мускул, диализиран). Общата активност на GPase се измерва в присъствието на 2 mmol 1 -1 AMP. Активната GPase е измерена без AMP.

Условията за анализ на глюконеогенните ензими са модифицирани от стандартните протоколи.

Малат дехидрогеназа (MDH; EC 1.1.1.37): 100 mmol l -1 Hepes (pH 7.4), 10 mmol l -1 KCl, 0.175 mmol l -1 NADH и 0.1 mmol l -1 оксалоацетат (Mommsen et al., 1980).

Фосфоенолпируват карбоксикиназа (PEPCK; EC 4.1.1.32): 100 mmol l -1 Hepes (pH 7.4), 10 mmol l -1 KCl, 10 mmol l -1 фосфоенолпируват, 0.5 mmol l -1 инозин дифосфат, 5 mmol l -1 MnCl2, 0,15 mmol l -1 NADH, 0,3 iu ml -1 малат дехидрогеназа и 20 mmol l -1 NaHCO3 (Opie and Newsholme, 1967). При оптимизиране на PEPCK анализа, инозин дифосфат (IDP) и 2-дезокси-гуанозин-5'-фосфат (2-dGDP) (Foster and Moon, 1990) са сравнени като акцептори на фосфорилна група. При IDP фоновите нива (без NaHCO3) са по-ниски, а специфичните нива (при NaHCO3) са по-високи, отколкото при 2-dGDP. Резултатните дейности на PEPCK са с до 50% по-големи с IDP, колкото акцептора на фосфорилната група. По-голямата активност не може да се дължи на конкурираща се активност на пируват киназа, тъй като анализът PEPCK се инициира с NaHCO3.

Фруктоза-1,6-бисфосфатаза (FBPase; EC 3.1.3.11): 100 mmol l -1 Hepes (pH 7.4), 10 mmol l -1 KCl, 2 mmol l -1 MgCl2, 1 mmol l -1 EDTA, 0.2 mmol l -1 NADP, 1.6 iu ml -1 фосфоглюкозна изомераза, 0,36 i.u. ml -1 глюкоза-6-фосфат дехидрогеназа и 0,05 mmol l -1 фруктоза 1,6-бисфосфат (Opie and Newsholme, 1967).

Глюкоза-6-фосфатаза (G6Pase; EC3.1.3.9): 100 mmol l -1 Hepes (pH 6.5), 10 mmol l -1 KCl, 26.5 mmol l -1 глюкоза 6-фосфат, 1.8 mmol l -1 EDTA, 2 mmol l -1 NAD, 1 iu ml -1 мутаротаза, 20 i.u. ml -1 глюкозна дехидрогеназа (Alegre et al., 1988). Този анализ е иницииран чрез добавяне на екстракт.

Максималната активност на ензимите се измерва в четирикратно в 96-ямков микроплотен спектрофотометър за четене (VERSAmax, Molecular Devices, Сънивейл, Калифорния, САЩ) при 27 ± 1 ° С. Скоростите на реакция са линейни за ≥3 минути. Степените от празни реакции (без субстрат) бяха извадени за всички определяния на ензимната активност. Единиците (i.u.) на ензимна активност се определят като количеството ензим, необходимо за превръщането на 1 μmol субстрат в продукт за 1 min при тези условия. Стойността 6,22 се използва като милимоларен коефициент на екстинкция за NAD (P) H. Всички ензимни активности бяха измерени в рамките на 5 часа от хомогенизирането на тъканите.

Биохимикали и свързващи ензими са закупени от Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA), Roche Diagnostics Corporation (Indianapolis, IN, USA) или Calzyme Laboratories, Inc. (San Luis Obispo, CA, USA). Когато е необходимо за отстраняване на излишния амониев сулфат, свързващите ензими се центрофугират при 12 000 ж в продължение на 10 минути и се разтваря отново в буфер за анализ [100 mmol l -1 Hepes (pH 7.4), 10 mmol l -1 KCl].

Протеинов анализ

Съдържанието на протеин в супернатантните фракции на тъканните хомогенати се определя чрез анализ на бицинхонинова киселина (Smith et al., 1985; Brown et al., 1989), модифициран за използване в 96-гнезден спектрофотометър за четене на микроплаки. Пробите се разреждат във вода до концентрация от приблизително 0,5 mg ml -1. Четирикратно повторени 10 μl проби бяха добавени към 200 μl от работния реагент на бицинхониновата киселина (Pierce Biochemicals, Rockford, IL, USA) в отделни ямки на 96-ямкова микроплака. Кладенците се запечатват и плочата се инкубира при 60 ° С в продължение на 30 минути. След охлаждане до стайна температура, плаката се отчита при 562 nm. Стандартите от 0-1 mg ml -1 говежди серумен албумин бяха включени във всяка плака.

Изчисления и статистически анализи

Резултати

Тъканни ензимни дейности

Ефекти на хипоксията върху ензимно специфични дейности

Хипоксията променя гликолитичните ензимни активности в белите скелетни мускули, черния дроб, сърцето и мозъка; обаче засегнатите ензими и посоката на реакцията на хипоксията са тъканно специфични (Таблица 1; Фиг. 1). Хипоксичната експозиция води до значително по-ниски специфични активности на осем от десет гликолитични ензима, измерени в белите скелетни мускули (P≤0.05; Фиг. 1А). Дейностите са намалени със 17% (PGM) до 55% (ENO). Другите два ензима (GAPDH и PGK) са по-ниски при хипоксия, отколкото при нормоксия, въпреки че тези разлики не са статистически значими. Ензимът HK е под границата на откриване в скелетните мускули. За разлика от ефекта на хипоксия в скелетните мускули, хипоксичната експозиция подобрява дейностите на пет от 11 гликолитични ензима, измерени в черния дроб (P≤0.05; Фиг. 1В). Дейностите са с 19% (PGI) до 74% (PGK) по-големи при хипоксия. В сърцето три гликолитични ензима имат по-високи специфични активности при риби, изложени на хипоксия (P≤0.05; Фиг. 1С), вариращи от 18% (TPI) до 28% (HK). В мозъка ефектите на хипоксията върху максималните ензимни активности са по-малки по размер и смесени по посока: три гликолитични ензима имат по-висока активност в мозъка от риби, изложени на хипоксия, докато единият има по-ниска активност (P≤0.05; Фиг. 1D). Процентните промени варират от 12% по-ниски (PGM) до 16% по-високи (HK) при хипоксия.

Специфични за гликолитичните ензими дейности (i.u. mg -1 протеин) в тъканите на Fundulus grandis, поддържани при нормални и намалени нива на кислород в продължение на 4 седмици при 27 ° C

Специфични дейности на ензимите на гликогеновия метаболизъм (i.u. mg -1 протеин) в тъканите на Fundulus grandis, държани при нормални и намалени нива на кислород в продължение на 4 седмици при 27 ° C

Специфичните дейности на ензимите, които участват в глюконеогенезата, са измерени само в черния дроб (Таблица 3; Фиг. 3). Ензимът на цикъла на лимонената киселина MDH катализира обратимото превръщане на оксалоацетат в малат, което може да е важно по време на глюконеогенезата като механизъм за преместване на редуциращи еквиваленти и скелети на въглерод от митохондрията към цитозола. Този ензим е значително по-висок при риби, изложени на хипоксия (P≤0.05). Ензимът FBPase катализира превръщането на фруктоза 1,6-бисфосфат във фруктоза 6-фосфат, заобикаляйки гликолитичната реакция, катализирана от PFK, а също така е по-висок при хипоксични риби (P≤0,05). И двата ензима са с около 25% по-високи при хипоксия. Два други ензима на глюконеогенезата, PEPCK и G6Pase, не се различават между нормоксични и хипоксични риби.