Самуел С. Хайсом

1 Катедра по анатомия и медицински изображения, Университет в Окланд, Окланд, Нова Зеландия

Марк Х. Викерс

2 Liggins Institute и Gravida: Национален център за растеж и развитие, Университет в Окланд, Окланд, Нова Зеландия

Lennex H. Yu

1 Катедра по анатомия и медицински изображения, Университет в Окланд, Окланд, Нова Зеландия

Клеър М. Рейнолдс

2 Liggins Institute и Gravida: Национален център за растеж и развитие, Университет в Окланд, Окланд, Нова Зеландия

Елвин К. Фърт

2 Liggins Institute и Gravida: Национален център за растеж и развитие, Университет в Окланд, Окланд, Нова Зеландия

3 Департамент по упражнения, Университет в Окланд, Окланд, Нова Зеландия

Сю Р. Макглашан

1 Катедра по анатомия и медицински изображения, Университет в Окланд, Окланд, Нова Зеландия

Свързани данни

Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Резюме

Въведение

През последните години младежкото затлъстяване стана тревожно често срещано и няколко мускулно-скелетни заболявания се свързват с по-голямо разпространение при затлъстяване в сравнение с деца и юноши без наднормено тегло [1–3]. Наличието на някои често срещани мускулно-скелетни нарушения в детска възраст е важен рисков фактор за ортопедично заболяване по-късно в живота. Например детската фрактура увеличава риска от фрактури по-късно в живота [4, 5]. Децата със затлъстяване имат голям риск да станат възрастни със затлъстяване [6, 7]. Затлъстяването е важен рисков фактор за остеоартрит (ОА) при възрастни и е свързано със сложни взаимодействия на хронично възпаление (както системно, така и локално в ставата), състоянието на чревната микробиота и имунната дисфункция [8–10]. Юноши с наднормено тегло или затлъстяване се оплакват от болки в ставите и са по-малко подвижни [11, 12] и по-малко склонни към енергична активност през детството. Остеоартритът може да бъде заболеваемост, свързана със затлъстяването при младите, и сега е включена като компонент на метаболитния синдром [13], чието разпространение се увеличава [14].

Мускулно-скелетните заболявания са добре документирани описателно по време на краен стадий на заболяването, но са трудни за проучване при или преди началото на хронично заболяване в ранен стадий. Това е особено приложимо при ставни заболявания при наднормено тегло или затлъстяване, което се характеризира с повишени концентрации на плазмени адипокини и възпалителни цитокини, за някои от които е известно, че засягат хрущяла [15-17]. Пълните последици от състоянието на младото затлъстяване върху мускулно-скелетната функция остават неясни на механистично ниво, особено затлъстяването през периода на растеж и развитие. Въпреки че системните и локални ставни адипокин и възпалителни цитокини са замесени в патогенезата на ОА (прегледани в [8, 15]), проучванията са ограничени до по-възрастни животни [17, 18]. Въпреки това, ефектите на цитокините върху хрущялите в развиващата се става (хиалинен ставен хрущял и епифизарен хрущял за растеж (EGC), понякога наричани артикуларно-епифизен-хрущялен комплекс [19] или ефектите от физическата активност в млада възраст имат не се изучава интензивно.

В настоящото проучване изследвахме 4-месечни мъжки плъхове, получени от нормална бременност, за да определим дали диетата с високо съдържание на мазнини (HF), въведена при отбиването, би довела до индуцирано затлъстяване, водещо до абнормни плазмени възпалителни биомаркери и морфология на бедрената и тибиален хиалин ставни и растежни хрущяли. Също така предположихме, че доброволната физическа активност с бягане с колело би имала значителен ефект върху защитата върху затлъстяването и ангажираността върху здравето на хрущяла.

Материали и методи

Животни

Всички съоръжения, процедури и провеждане на изследването са одобрени от Комитета по етика на животните към университета в Окланд. Мъжките плъхове за отбиване на Sprague-Dawley (n = 40, на възраст 21 дни - d21) са настанени по двойки, в стандартни клетки с размер 40,6 x 50,8 x 20,9 cm, поддържани при 25 ° C и 12/12h светлина: тъмен цикъл. Плъховете са получени от звеното за животни на Върнън Янсън, Университета в Окланд. Теглото и консумацията на храна се записват два пъти седмично и водата е на разположение свободно. От d21 до d63 плъховете са имали свободен достъп или до диета с високо съдържание на мазнини (HF) (45% kcal от мазнини, D12451; Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ), или до контролна диета Chow (18% kcal от мазнини, 2018 Харлан Теклад, Великобритания). От d63 – d121, половината от всяка диетична група е имала само спонтанно упражнение за активна клетка (SED), докато другата също може доброволно да се упражнява на бягащо колело. Това даде 4 групи в балансиран дизайн (n = 10 на група), хранени или с чау, или с високочестотна диета, със или без 8-седмично упражнение от d63-65 до d121, посочени по-долу като HF-SED, HF-Ex, Chow-SED и Chow-Ex.

Записване на упражнения на колела

Активността на двойки плъхове се записва в продължение на 24 часа в един ден на или близо до d70, 80, 90, 100 и d110, а активността на упражнението за бягане с колело (бягане на разстояние в метри) се записва на всеки 15 минути (Lafayette Instrument Company, Lafayette, IN), освен по време на кратки процедури като почистване на клетката и осигуряване на храна/вода. Данните показват, че 96,2% от общата активност на упражненията и на двете групи упражнения е натрупана между 18:00 и 6:00 сутринта и по този начин е извършен анализ само на данните за тъмния период, след изваждане на кратките интервали на активност на светлинния период от общото 24-часово разстояние. Кумулативното разстояние за бягане се изчислява от 5-те периода на измерване на клетка за всяка група. Не се измерва спонтанно движение на двойки плъхове в клетките.

Състав на тялото и мерки за размер на тялото

Двуенергийно рентгеново абсорбциометрично сканиране (DXA) сканиране (Lunar Prodigy, GE, Waltham, USA) беше проведено на d117, под лека изофлуоранова анестезия с плъх в стернална легнало положение. Съставът на тялото (мазнини и слаба маса) беше изчислен с помощта на специален софтуер за животни (Lunar Prodigy, Madison, САЩ). На d119-122 плъхове се гладуват цяла нощ и се убиват чрез обезглавяване след анестезия с натриев пентобарбитон (60 mg/kg, IP). Лявата бедрена кост с отстранени всички връзки и сухожилия е измерена с помощта на цифров апарат.

Биомаркери на кръвната плазма

Кръвта незабавно се събира в вакууанери EDTA, държи се на лед до центрофугиране в продължение на 15 минути при 3000 g и плазмена супернатанта се съхранява при -80 ° C за анализ на биомаркер. Концентрацията на лептин и инсулин бяха определени с помощта на търговски наличен ELISA, специфичен за плъхове (CrystalChem, IL, САЩ, Cat # 90040 и # 90060, съответно), и интерлевкин (IL) 1β и IL6, използвайки ELISA за плъхове (R&D Systems MN, USA; RLB00, R6000B), съгласно инструкциите на производителя. IL1α, IL10, интерферон (IFN) γ и фактор на туморна некроза (TNF) α се измерват с помощта на BD ™ цитокиновия масив (BD Bioscience, Окланд, Нова Зеландия), BD Accuri C6 Flow Cytometer и BD Accuri C6 Software. Концентрациите на цитокини бяха изчислени с помощта на FCAP Array Software v3. Всички получени стойности са над минималната откриваема граница.

Хистология и степенуване на феморо-тибиалната става (FTJ)

След трансекция през дясната дистална част на бедрената кост и проксималната тибия, всяка цяла феморо-тибиална става (FTJ) се събира в рамките на 10 минути и се поставя в 4% параформалдехид за 48 часа при стайна температура и след това се измива 3 пъти за 10 минути в 0,1М фосфат- буфериран физиологичен разтвор (PBS). Ставите се декалцифицират в (35%) разтвор на буферирана мравчена киселина/формиат в продължение на 13 дни при стайна температура преди стандартната хистологична обработка във восък. Сагитални срезове (8 μm) се събират на всеки 200 μm от цялото съединение и се монтират върху предметни стъкла с покритие от поли-L-лизин. Определен е референтен участък както от медиалния, така и от страничните кондили, като се използват следните характеристики: проксимална степен на преден и заден феморален HAC на приблизително едно и също ниво, липса на връзка на предни и задни менискални рога, липса на прикрепяне на тибиални или бедрени кръстни връзки в раздел. Сечението 400μm странично и 400μm медиално за всеки от двата референтни участъка бяха избрани за изследване, което доведе до общо 6 участъка на ставата. Секциите бяха оцветени с толуидиново синьо и изобразени с помощта на скенер за слайдове MetaSystems VSlide (версия 2.1.124), работещ с Metafer4 (версия 3.9.2) с цел 20X (NA 0.9). Изображенията бяха разгледани с помощта на софтуера MetaSystems VS Viewer (Версия 2.0).

Отделна система за точкуване (Таблица 1), усъвършенствана от предишна класификация [20], е създадена за оценка на морфологичните промени в EPG, които са представени на фиг. Селекция от 72 слайда бяха отбелязани на два отделни случая от двама заслепени изследователи (SM и LY) и показаха съгласие между оценителите от 99,3% и съгласие между участниците от 95,1%.

след

Степен 0 показва хиалинен ставния хрущял (HAC) и tidemark (черна стрелка). Степени 1 и 2 показват задържан епифизарен хрущял на растежа (EGC), съдържащ хипертрофични клетки с оцветени в толуидин синьо лакуни (върхове на стрелки; степен 1), а при степен 2 фиброза, оцветена в синьо, е налице между задържания EPG и субхондралната кост (черна стрелка) и кухина/киста във фиброзната тъкан (*). Лезии от степен 3 не са открити в това проучване.

маса 1

Постоянна дебелина на EGC

По дължината на HAC:

Последователна, приблизително вертикална зонална организация на хондроцитите

Вижда се плътно дефинирана тънка марка

Постоянна дебелина на ACC, която следва контурите на подлежащата кост.

EGC е фокално удебелен - простиращ се в подлежаща епифиза

Запазен EGC, характеризиращ се с:

Нередовна организация на хондроцитите

Намален обем на ECM

Tidemark частично или напълно неразличим

Инфилтрация на толуидиново синьо петно ​​в хондроцитни лакуни в задържания EGC.

Малки кухини или кухини, образувани между хондроцитите в задържания EGC.

Фисура (и) в хондро-костна връзка или в рамките на задържания EGC. Пукнатините са или:

Непрекъснато по цялата дължина на задържания EGC или,

Множество пукнатини с по-малка дължина

и/или,

Фиброзна тъкан в зоната на SCB, в области, които са в непосредствена близост до фисурата (ите).

Фисурата (ите) в хондро-костната връзка или в рамките на задържания EGC, са непрекъснати до повърхността на HAC (Kato et al., 1984), образувайки:

Клапа от HAC, ACC и EGC тъкан, която се проектира в ставната кухина

или,

Пълно разделяне на клапата, съдържаща HAC, ACC и EGC, образувайки свободно тяло.

Фиброзна тъкан или подобна на киста лезия (и) в епифизата или в непосредствена близост до клапата или цепнатината.

HAC - хиалинен ставен хрущял, ACC - ставен калциран хрущял, SCB - субхондрална кост, ECM = извънклетъчен матрикс

Класовете и свързаните с тях морфологични характеристики на епифизарния растежен хрущял (EGC) от [20]. Изброени са и допълнителни характеристики, които са общи за всеки клас. За определена степен са необходими всички изброени основни характеристики.

Всяко от шестте изображения на FTJ от всяко животно беше оценено в 4-те ставни области: медиален феморален кондил, страничен феморален кондил, медиално тибиално плато, странично тибиално плато, използвани в системата за точкуване. Броят на плъховете с една или повече лезии е изразен като процент. Присвоената оценка от всички 6 раздела на ставата беше сумирана, за да се определи степента и тежестта на лезиите в цялата става. Също така изследвахме дали лезиите са по-често локализирани в медиалния или страничния аспект както на пищяла, така и на бедрената кост.

Колаген тип X имунохистохимия

Проведен е имунохистохимичен анализ на лезии от степен 1 ​​от всички групи (като се използва следващата серийна секция на 200μm разстояние). Разделите от степен 0 бяха използвани като контроли. Вградените в парафин срезове бяха обезпарафинирани, инкубирани в тестикуларна хиалуронидаза (2 mg/ml) за 1 час при 37 ° C, изплакнати в дестилирана вода преди етикетиране с моноклонален колаген тип X антитяло (1: 200; клон X53, eBioscience Inc, САЩ) в продължение на 2 часа при стайна температура, след което се открива с помощта на комплекта HRP Polymer Bundle Mouse-on-Rat HRP (Biocare Medical, USA), съгласно инструкциите на производителя. Секциите бяха оцветени с хематоксилин, дехидратирани и монтирани в DPX.

Статистически анализ

Средното разстояние за бягане и в двете тренирани групи постепенно се увеличава до d100, като най-ниското разстояние, изминато на d70 като плъхове се аклиматизират към колелото. Нямаше разлики между Chow-EX и HF-EX в нито един от измерените дни или в общото общо изминато разстояние (сумирана средна активност през петте измервателни дни) между тренираните групи (Фиг. 2G и 2H).

Морфология и степенуване на хрущяла

Използвайки насоките за оценяване на OARSI за FTJ на плъх [21], не е открита аномалия в контура или повърхностната цялост на ставния хрущял; няма данни за изчерпване на матрицата в HAC. Ставните тъкани от степен 0 показват постоянна дебелина в целия ставен ръб и са по-тънки в предните области, отколкото отзад. HAC показва редовно плътно дефиниран tidemark, правилно подреждане на хондроцитите и калцифицираният хрущял следва контурите на подлежащата кост (Фигура 3А) Хрущял от степен 1 ​​съдържа удебелени области на EGC, оцветени в синьо от толуидин, непосредствено в съседство с HAC. HAC показа равномерно оцветяване с толуидин и редовно зонално разположение на хондроцитите, подобно на хрущял от степен 0. Тидмаркът обаче бе нарушен и присъстваше само периодично по ширината на задържания EGC регион, където хондроцитите бяха хипертрофични в рамките на лакуни, инфилтрирани с толуидиново синьо оцветяване. Хондро-костното кръстовище следва контурите на EGC, който се проектира неравномерно в подлежащата субхондрална кост (Фигура 3А).

По-голям брой лезии са открити в пищяла (57%) в сравнение с бедрената кост (43%), по-голямата част от които са разположени отзад, в непосредствена близост до задния рог на страничния или медиалния менискус. Лезиите са най-често срещани в страничната пищял във всички групи, с изключение на Chow-EX, при която е идентифицирана само една лезия от степен 1, в страничния бедрен участък на бедрената кост.

Няма данни за задържан растежен хрущял в метафизалните растежни плочи (физи) (Фигура 4). Тибиалните физи от всяка група показват постоянна височина и показват морфологични характеристики на млади възрастни плъхове. Това включва колони от пролифериращи клетки (често стесняващи се в проксималния аспект към зоната на покой), с големи площи на безклетъчност с ECM, оцветени с толуидиново синьо, 4-5 реда хипертрофични клетки и много малко откриваеми клетки в покой.

В нито една група не са открити лезии или области на задържан растежен хрущял. * обозначава региони на безклетъчност, обща характеристика на физите на плъхове на възраст над 16 седмици.

Колаген тип X

За да се провери дали EGC лезиите се дължат на задържане на хипертрофични хондроцити, лезиите от степен 1 ​​се маркират с колаген тип X антитяло и се сравняват със секции от степен 0. В здрави участъци от степен 0, колаген X присъства само в околоклетъчните зони, заобикалящи последните 2-3 реда хипертрофични хондроцити, в непосредствена близост до хондро-костната връзка (Фигура 5А) и в хипертрофичната зона на метафизарната растежна плоча (Фигура 5В ). За разлика от това, при лезии от степен 1, задържаните EGC региони са имали интензивно оцветяване с колаген тип X в перицелуларни области на всички клетки в лезията, които са имали до 9 слоя хипертрофични хондроцити (Фигура 5D); Фигура 5С показва отрицателно контролно изображение (без първично антитяло) от съответна секция.

(А) Етикетиране на колаген тип X (кафяво) в хиалинния ставен хрущял в участък с степен 0. Оцветяването е специфично локализирано в хипертрофични клетки под марката. (B) Разпределение на колаген тип X в метафизарната растежна плоча. (C) Секция с отрицателен контрол (без първично антитяло) на лезия от степен 1. (D) Разпределение на колаген тип X в рамките на задържания епифизен растежен хрущял.

Плазмени биомаркери

Средната концентрация на лептин в плазмата на гладно беше

4,5 пъти по-висок при HF- от групите, хранени с чау (p Таблица 2). По същия начин средната концентрация на инсулин в плазмата на гладно е значително променена (по-висока при HF-хранени, отколкото при групи, хранени с Chow, p Таблица 2). Средната концентрация на IFNγ не се влияе от диетата, но е по-ниска в EX от групите с SED, но само в групите, хранени с Chow, а не с HF, със силни основни и взаимодействащи ефекти (p Таблица 2).

Таблица 2

Взаимодействие със заседнало упражнениеChowHigh мазниниChowHigh мазнини
Лептин5,91 (0,86)27,26 (5,89)1,86 (0,37)8,61 (1,68)p Таблица 3). Няма значителни разлики в телесната маса, чистата маса, инсулина и всички останали плазмени цитокини между групи със и без лезии.

Таблица 3

Статистическата значимост на асоциацията е оценена чрез U-тест на Mann-Whitney. Няма лезии (n = 18) и групи лезии (n = 22) и * p (23K, xlsx)

Благодарности

Благодарим на Сатя Амирапу за хистологични съвети и помощ, на Клер Баркър и Крис Хеджис за техническа помощ и на звеното за изследване на биомедицински изображения за обучение и достъп до Metasystems Vslide Scanner.

Отчет за финансиране

Тази работа беше подкрепена от грант номер R238, Arthritis New Zealand (ECF, SRM, MHV), www.arthritis.org.nz; Гравида Национален център за магистърска стипендия за растеж и развитие (SSH), www.gravida.org.nz. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Наличност на данни

Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.