Институт за изследване на пчелите, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, Jiangxi, China

размерът

Катедра по ентомология, Държавен университет в Мичиган, Източен Лансинг, Мичиган, Съединени щати, Програма за екология, еволюционна биология и поведение, Държавен университет в Мичиган, Източен Лансинг, Мичиган, Съединени американски щати

Институт за изследване на пчелите, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, Jiangxi, China

Институт за изследване на пчелите, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, Jiangxi, China

Институт за изследване на пчелите, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, Jiangxi, China

Институт за изследване на пчелите, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, Jiangxi, China

  • Юан Юан Ши,
  • Захари Й. Хуанг,
  • Zhi Jiang Zeng,
  • Zi Long Wang,
  • Сяо Бо Ву,
  • Вей Ю Ян

Фигури

Резюме

Заден план

Младите ларви на медоносната пчела (Apis mellifera) са тотипотентни; те могат да станат или кралици (репродуктивни), или работници (до голяма степен стерилни помощници). Доказано е, че ДНК метилирането играе важна роля в тази диференциация. В това проучване ние изследваме приноса на диетата и размера на клетките за кастова диференциация.

Методология/Основни констатации

Измерихме активността и генната експресия на един ключов ензим, участващ в метилирането, Dnmt3; скоростите на метилиране в гена динактин р62; както и морфологичните характеристики на възрастните пчели, развити или от ларви, хранени с работническо желе или пчелно млечице; и ларви, отгледани в маточници или работнички. Ние показваме, че както диетата, така и размерът на клетките са допринесли за диференциацията на кралицата-работник и че двата фактора са повлияли на различни места на метилиране в един и същ ген динактин p62.

Заключения/Значение

Потвърждаваме предишни констатации, че Dnmt3 играе критична роля в диференциацията на кастата на медоносните пчели. Освен това, за първи път показваме, че размерът на клетките също играе роля за влияние върху развитието на ларвите, когато диетата се запазва същата.

Цитат: Shi YY, Huang ZY, Zeng ZJ, Wang ZL, Wu XB, Yan WY (2011) Диетата и размерът на клетките засягат диференциацията на кралицата-работник чрез метилиране на ДНК в медоносните пчели (Apis mellifera, Apidae). PLoS ONE 6 (4): e18808. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0018808

Редактор: Майкъл Фрейтаг, Държавен университет в Орегон, Съединени американски щати

Получено: 3 ноември 2010 г .; Прието: 12 март 2011 г .; Публикувано: 26 април 2011 г.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от Китайската система за научни изследвания в селското стопанство (№ CARS-45), Националната фондация за естествени науки на Китай (№ 31060327), Докторския фонд на Министерството на образованието на Китай (№ 20103603110003) и Мичиганската селскостопанска експериментална станция в Мичиган Държавен университет. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Медоносната пчела (Apis mellifera) е силно евсоциално насекомо и се характеризира със своето сложно разделение на труда, танцова комуникация за ефективно използване на ресурсите и висока степен на сплотеност, функционираща като „суперорганизъм“ [1]. Нормалната пчелна пчелна колония се състои от една репродуктивна матка, от няколко до няколко хиляди хаплоидни търтеи (в зависимост от сезона) и десетки хиляди нерепродуктивни работнички. Въпреки че и кралицата, и нейните работници са генетично идентични, кралицата е репродуктивен член и активира яйчниците си малко след чифтосването, докато работниците имат силно намален брой овариоли и могат да произведат ограничен брой яйца, когато се активират (при условия без майки) ). Освен броят на овариолите, кралиците и работниците проявяват огромни разлики в морфологията, поведението, физиологията и дълголетието [2] - [4].

Най-новото откритие е, че метилирането на ДНК е замесено в определянето на каста. Wang et al. [11] първо установи, че медоносните пчели имат система за метилиране на ДНК с два активни ортолога на гръбначни ДНК метилтрансферази, Dnmt1 и Dnmt3 [11]. След това беше показано, че Dnmt3 участва в определянето на каста при медоносните пчели [12]. Заглушаването на този ген при новоизлюпените ларви води до намалени нива на метилиране, което води до значително по-висок дял на майките. Следователно намаленото метилиране изглежда имитира ефекта на пчелното млечице (RJ). Кучарски и др. [12] също така определя процента на метилиране на 10 CpG места в динактин р62, ген, който реагира на диетичните промени при дрозофила. Отново, инжектирането на двуверижна Dnmt3 РНК води до намалени нива на метилиране в динактин p62, когато 10 CpG места се разглеждат заедно. Това имитира високите нива на метилиране при ларвите на работниците и ниските нива на метилиране при ларвите на майките, когато се отглеждат в колонии.

Въпреки че ефектите от храненето върху определянето на каста са добре проучени [10], [12], [13], [14], дали разликата в размера между работните и маточните клетки също допринася за определянето на каста, не е ясно. В това проучване ние докладваме ефектите както на храненето, така и на размера на клетките върху активността на Dnmt3, неговата генна експресия и произтичащия от това фенотип на възрастни пчели. Също така тествахме хипотезата, че храненето и размерът на клетките влияят върху метилирането на различни CpG места в динактина p62.

Резултати

Отделни места на CpG, разпределени между почти всички екзони на гена динактин p62, са показани на фиг. 1. Две места (CpG9 и 13) не са открити да имат метилиране и не са представени в таблица 1. Две места (CpG1,2, CpG13, 14) са имали две CpG места твърде близо, за да бъдат разделени и са отчетени като един сайт в таблица 1.

Праймерите за полимеразна верижна реакция са проектирани да покриват повечето от CpG сайтовете, с изключение на тези в екзони 6 и 9. Числа 1-14 се отнасят до местоположенията на CpG сайтовете и подчертаването подчертава тези единици с две тествани CpG сайтове едновременно. За CpG 9 и 13 не открихме никакво метилиране и те не бяха отчетени в таблица 1.

Ефект на диетата върху кастовата диференциация

Ларвите, хранени с пчелно млечице за различна продължителност, водят до много различни физиологични промени. Ларвите, хранени с RJ за по-дълго време, доведоха до значително по-ниски активности на Dnmt3 (фиг. 2А), значително по-ниска експресия на dnmt3 иРНК (фиг. 2Б) и значително по-ниски нива на метилиране за гена динактин р62 (фиг. 2С) (Р Фигура 2 Ефект от храненето на ларви с 3, 4 или 5 дни пчелно млечице.

Показани са Dnmt3 ензимна активност в mmol/min (A), Dnmt генна експресия (B) спрямо референтен ген калмодулин и процент на метилиране в гена dynactin p62 (C) в 6-дневни ларви и процент възрастни, класифицирани като дами, интеркасти или работници (D). Различните букви в горната част на лентите показват значителна разлика (P 2 (P Фигура 3. Ефект от размера на клетките върху ларвите на медоносните пчели).

Показани са Dnmt3 ензимна активност в mmol/min (A, D), експресия на гена Dnmt3 (B, E) спрямо референтен ген калмодулин, процент на метилиране в гена динактин p62 (C, F) за 3 дни (вляво) и 5-дневни ларви (вдясно), а процентът на възрастните се очертава като работници (G). Тук неработещите (19% за маточници) бяха интеркасти. Анализът на данните и трансформацията са същите като на фиг. 2.

Дискусия

Резултатите от това проучване показват, че 1). Увеличаването на продължителността на пчелното млечице води до степенуван отговор в намалена ензимна активност на метилтрансфераза, намалена експресия на гена на метилтрансфераза и намалено метилиране в гена динактин р62, което от своя страна води до значително увеличение на маточниците и намаляване на работниците или интеркастите; 2). Размерът на клетките също допринася за кастовата диференциация; по-големите маточни клетки доведоха до по-ниска ензимна активност на метилтрансфераза, по-ниска експресия на гена на метилтрансфераза и по-нисък процент на метилиране в гена динактин р62, което доведе до значително по-нисък процент на произведени работници и 3). Типът на диетата и размерът на клетките, макар и да действат върху кастовата диференциация чрез модулация на активността на метилтрансферазата, нейната генна експресия и скоростта на метилиране на динактин р62, засягат различни места за метилиране на CpG. Тези резултати предполагат, че размерът на клетките, по-рано пренебрегван фактор, също допринася за диференциацията на кастите.

Добре известно е, че работните ларви на възраст до 3 дни все още могат да се развият до предимно краличен фенотип [5]. Следователно очаквахме да не наблюдаваме разлики между двете групи от 3-дневни ларви, отглеждани в клетки с различен размер, тъй като и двете получават една и съща диета. Вместо това, ние забелязахме, че при 3-дневни ларви всички измерени отговори (активност на Dnmt3, експресия и процент метилиране) се различават значително между ларвите, отглеждани от маточната чаша и работните клетки (Фиг. 3 A-C). Това предполага, че дори на 3-дневна възраст ларвите по някакъв начин са открили разлики в средата си за отглеждане, въпреки че ларвите са все още относително малки (в сравнение с размера на работната клетка). Тези разлики не стават поразително по-големи, когато ларвите са на 5 дни (фиг. 3D-F). Ограничението на пространството е единственото обяснение за наблюдаваните разлики, защото премахнахме гравитационния фактор (в колонията маточните клетки са ориентирани по различен начин от работните клетки) в лабораторните условия за отглеждане на ларви.

В допълнение към експресията на Dnmt3 и скоростта на метилиране в гена динактин p62, ние също измерихме ензимната активност на Dnmt3 (фиг. 2А, 3А и 3D). Визуално сравнение на фиг. 2А спрямо 2В предполага, че ензимната активност на Dnmt3 представлява по-чувствителен анализ в сравнение с експресията на Dnmt3, тъй като разликите между 3 и 5 „дни, хранени с пчелно млечице“ са по-поразителни в активността на ензима Dnmt3, отколкото експресията на Dnmt3 нива. Двете измервания обаче стават сходни в експеримента с клетъчен тип (Фиг. 3А, В и D, E). Тези резултати предполагат, че двата фактора (тип диета и размер на клетките) влияят по различен начин върху активността на Dnmt3 и неговата генна експресия.

Резултатите в таблица 1 показват, че видът на диетата и размерът на клетките са засегнали различни сайтове на CpG. Диетичният тип значително повлиява степента на метилиране на динактин р62 на места 4, 5, 8 и 14, докато засегнатите от размера на клетките места 1/2, 3, 4, 7, 8 и 10. Само места 4 и 8 са засегнати и от двете фактори и сайт 6 и 11/12/не са засегнати от нито един. Това предполага, че двата фактора могат да действат по два различни пътя. Различните гени могат да бъдат диференцирано метилирани, когато тези два фактора се манипулират, но това се нуждае от допълнително експериментално потвърждение.

Резултатите от фиг. 2D показват, че промяната на диетата на ларвите от 3 дни RJ на 5 дни RJ намалява работниците от 57% на 0%, което предполага пълна смяна поради диетични манипулации. Фиг. 3G показва, че 100% от ларвите, когато пребивават в работни клетки, стават работници, докато 81% стават работници, когато пребивават в маточни чашки. Останалите 19% са от интеркасти без произведена царица. Промяната в дела на работниците е настъпила единствено поради разликата в размера на клетките, тъй като и двете групи са били хранени с една и съща диета (WJ, добита от 3-дневни ларви). Това представлява 19% намаление на работниците, около една пета от ефекта на диетичния ефект (това е, ако пренебрегнем факта, че интеркастите не са дами). Тези резултати предполагат, че въпреки че размерът на клетките може да повлияе на кастовата диференциация, ефектът му е по-слаб в сравнение с диетичния ефект.

ДНК метилирането се превърна в основен фокус в изследванията на пчелите [12], [15], [16] след първоначалното му откриване в системата [11]. Нашето изследване за първи път измерва дейностите на метилтрансферазата Dnmt3 и предоставя доказателства, че клетъчните типове влияят и върху метилирането на ДНК, което води до разлики в развитието на царицата. Необходими са допълнителни проучвания, за да се разбере как информацията за разликата в размера на клетките се трансформира във физиологични промени в двете касти.

Материали и методи

Западното медоносно пчело, Apis mellifera, се използва през цялото това проучване. Колониите на медоносните пчели се поддържат в Изследователския институт по пчелите, Земеделски университет Дзянси, Нанчанг, Китай (28.46 ° с.ш., 115.49 ° изток), съгласно стандартните пчеларски техники. Всички експерименти са проведени в една колония, за да се осигури генетично сходство между използваните ларви.

Ефект на диетата върху кастовата диференциация

През първите три дни личинките на медоносните пчели се отглеждат в пластмасови маточни чашки в колонията. Тези ларви не се нуждаят от присаждане, тъй като яйцата се слагат директно в маточни чаши, като затварят матката в специална клетка. След това тези маточни чаши могат да бъдат отделени и използвани за производство на пчелно млечице (RJ) [17]. След първите три дни ларвите се разделят на три групи и се отглеждат в същите маточни чаши в инкубатор (35 ° C и 78 ± 7% RH). Трите групи получават или новосъбрани RJ (събрани същия ден от една и съща колония) в продължение на 2 дни (5-дневен RJ), или RJ за първия ден, след това прясно събрани работни желе от стари ларви (WJ) (4-дневни RJ), или WJ само за 2 дни (3-дневен RJ). Ларвите се прехвърляха на всеки 12 часа в маточни чаши с нова храна (200 µl на чаша). На 6-ия ден бяха взети по четири проби за определяне на ензимната активност, генната експресия на Dnmt3 и скоростта на метилиране, като всяка проба съдържаше 10 глави на ларви. Експериментът е повторен в две отделни опити (1060 ларви на опит), като се получават 8 проби (всяка с 10 глави на ларви) на група.

Ефект от размера на клетките върху кастовата диференциация

Ларвите на медоносните пчели се отглеждат в пластмасови маточни чашки или работни клетки в инкубатор (35 ° C, 78 ± 7% RH) от ден 1 (в рамките на 24 часа от излюпването на ларвите). Всяка клетка се грундира с 200 µl прясно събрана WJ (събрана от 3-дневни работни ларви същия ден) преди ларвата да бъде прехвърлена в нея. Чашите Queen бяха от същия тип като първия експеримент. Работните клетки бяха върху парчета естествен гребен от пчелен восък (всеки около 398 × 152 mm). Ларвите се прехвърляха на всеки 8 часа в маточници или работнички с нова храна. Ларвите са взети проби на ден 3 (цели ларви) и ден 5 (само глави) за същите три параметъра като първия експеримент, с N = 8 проби за всеки параметър (активност Dnmt3, експресия на гена и скорости на метилиране) с всяка проба съдържащи 10 ларви или глави. На 6-ия ден зрелите ларви бяха прехвърлени в 6-клетъчни плаки за тъканна култура (Costar, NY, USA), облицовани с парче Kimwipe и държани в инкубатор (35 ° C и 78 ± 7% RH) за какавидиране [18]. Общият процент на поява (ларви на възраст 1 ден при възрастни) е 56,6%. Взехме проби от 80 възрастни пчели на група, за да оценим техните морфологични характеристики. Отгледахме 1400 ларви за всеки опит и експериментът беше повторен в две различни опити.

Експериментални подробности

Реколта от RJ и WJ.

RJ е произведен в съответствие със стандартните практики в Китай [19]. Накратко, кралицата беше отделена от останалата част на колонията от кралица без дъска. Чашките с кралици с млади ларви (на един ден) бяха въведени в колонията и им беше позволено да се хранят от работниците в продължение на 2 дни. След това личинките се отстраняват и пресният RJ се отстранява с помощта на шпатула и се съхранява при 4 ° C до употреба. За да придобием работническо желе от стари ларви, първо внимателно отстранихме 3-дневни ларви, като използвахме или инструмент за присаждане, или чифт форцепс, след което отстранихме WJ с помощта на шпатула. В експеримент 1 и RJ, и WJ произхождат от същата колония като експерименталните ларви.

Измерване на активността на ДНК метилтрансфераза 3.

Ядреният екстракт от ларви се приготвя по протокола на EpiQuik ™ Nuclear Extraction Kit (Epigentek, Бруклин, Ню Йорк, САЩ). Активността на Dnmt3 беше тествана съгласно процедурата на EpiQuik ™ ДНК метилтрансферазна активност/инхибиторен комплект за анализ (Epigentek, Бруклин, Ню Йорк, САЩ). Абсорбцията при 450 nm беше отчетена на Multiskan MK3 Microplate Reader (Thermo Fisher Scientific Shanghai Instruments Co Ltd, Шанхай, Китай).

Измерване на експресията на гена на ДНК метилтрансфераза 3.

Общата РНК беше изолирана съгласно процедурата Trizol/QIAGEN RNeasy (QiaGen, САЩ). Синтезът на cDNA се извършва с помощта на Revertra Ace (Тойобо, Япония) съгласно инструкциите на производителя. За справка е използван калмодулиновият ген на пчелна пчела. Праймери за Dnmt3 и калмодулин са от Ying et al. [11] и Kucharski et al. [12], съответно. Параметрите на колоездене бяха: 94 ° C, 2 минути, 40 × (95 ° C, 10 секунди, 60 ° C, 15 секунди, 72 ° C, 15 секунди) и 72 ° C, 10 минути. За извличане на количествени данни е използван софтуерът RotorGene v6.0 (Corbett Research, Австралия).

Измерване на метилиращия статус на динактин р62.

Общата ДНК се изолира съгласно протокола на комплекта за екстракция на геномна ДНК от PUEX на животни (Кат. № 3625031 PUEX, Пекин, Китай). След това пречистена ДНК (> 50 ng на проба) е изпратена до CapitalBio (Пекин, Китай) за количествен анализ на метилиране, техният протокол е публикуван в Wang et al. [20]. Накратко, глобалните скорости на метилиране бяха определени с Methylamp Global DNA Methylation Quantification Ultra Kit (Epigentek, Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ). За индивидуално определяне на мястото на метилиране, геномната ДНК първо беше обработена с бисулфит с комплекта за модифициране на ДНК на метиламп (Epidgentek). Тогава количественият анализ на метилирането беше направен от платформата Sequenom MassRARRAY (CapitalBio, Пекин, Китай). Системата използва матрична асистирана лазерна десорбция/йонизация по време на полет (MALDI-TOF) масспектрометрия, комбинирана с РНК-специфично разцепване (MassCLEAVE).

Следват последователностите на три праймера, използвани за динактин p62 (XP_001121083):

  1. dynactin_1-10F: aggaagagagGAAGATTTATTTTTGTAGGTATTGTT
    dynactin_1-T7R: cagtaatacgactcactatagggagaaggctTTACTCTTAAAAATACATATCCAACTC
    dynactin_2-10F: aggaagagagAATTAGTTATAGGAGGTTGGTTTGAA
    dynactin_2-T7R: cagtaatacgactcactatagggagaaggctAATTCCTCTACTTCTATACTAACAACAA
    dynactin_3-10F: aggaagagagATTAGAAGTAAGGATTGTTATTTGTGAA
    dynactin_3-T7R: cagtaatacgactcactatagggagaaggctTCATCATATTCAACAACATCATCTCT

Измерване на морфометрията.

След поникване при възрастни, всеки индивид е измерван за теглото си на поникване (с точност до 1 mg). Други морфологични характеристики бяха измерени с помощта на цветна камера за видеонаблюдение Panasonic (WV-GP240, Suzhou Co Ltd) и компютърна система за графичен анализ (T20080324-X0690-Z, Beijing TianHong Precision Instrument Technology Co. Ltd, Китай). Те включват дължина на тялото, дължина и ширина на задното крило, дължина на хобот и дължината на третия тергум. Яйчници от пчели от маточници, подобни на маточници и работни пчели бяха дисектирани под дисекционен обхват и преброени според Li и Xiao [21]. Също така отбелязахме наличието или отсъствието на корбикули на задния крак на всяка възрастна пчела. Работниците, интеркастите и кралиците бяха идентифицирани въз основа на броя овариоли на яйчник и наличие/отсъствие на корбикули, както беше описано по-рано [12].

Анализ на данни.