Hye Kyung Baek

1 Катедра по биомедицински лабораторни науки, Колеж по медицински науки, Университет Soonchunhyang, Асан 31538, Корея.

Хиеджи Шим

1 Катедра по биомедицински лабораторни науки, Колеж по медицински науки, Университет Soonchunhyang, Асан 31538, Корея.

Hyunmook Lim

1 Катедра по биомедицински лабораторни науки, Колеж по медицински науки, Университет Soonchunhyang, Асан 31538, Корея.

Минджу Шим

1 Катедра по биомедицински лабораторни науки, Колеж по медицински науки, Университет Soonchunhyang, Асан 31538, Корея.

Чул-Кю Ким

2 Катедра по медицински биотехнологии, Колеж по медицински науки, Университет Soonchunhyang, Асан 31538, Корея.

Парк Санг-Кю

2 Катедра по медицински биотехнологии, Колеж по медицински науки, Университет Soonchunhyang, Асан 31538, Корея.

Йонг Сок Лий

3 Департамент по наука за живота и биотехнологии, Колеж по естествени науки, Университет Soonchunhyang, Асан 31538, Корея.

Песен Ки-Дук

4 Геномен информатичен център, Национален университет Han-kyong, Anseong 17579, Корея.

Сунг-Джо Ким

5 Катедра по биотехнологии, Университет Хосео, Асан 31499, Корея.

Сун Шин Йи

1 Катедра по биомедицински лабораторни науки, Колеж по медицински науки, Университет Soonchunhyang, Асан 31538, Корея.

Резюме

Въведение

Мастната тъкан играе роля в акумулирането на енергия и терморегулацията и служи като източник на различни хормони, включително адипокини и цитокини [11,12,36]. Мастната тъкан е от съществено значение за усвояването на мастноразтворимите витамини [35] и за състава на клетъчната мембрана [30]. Въпреки това, постоянният прием на диети с високо съдържание на мазнини причинява затлъстяване чрез прекомерно увеличаване на адипогенезата в организма. Повишеното натрупване на мазнини води до сериозни отрицателни усложнения като повишена инсулинова резистентност, артериосклероза, сърдечно-съдови заболявания, хиперлипидемия и захарен диабет [18,34,41].

В западните страни много хора консумират диети с високо съдържание на мазнини или калории без редовни упражнения. Следователно много фармацевтични компании започнаха разследване на лекарства, насочени към затлъстяването. Въпреки това, няколко обещаващи лекарства против затлъстяване са били отказани, тъй като са показали неочаквани странични ефекти при хората [4,31].

Artemisia annua (AA), добре познат агент против малария [23,29], наскоро беше показан да намалява диференциацията на адипоцитите в много in vitro проучвания, понижавайки нивото на активирания от пероксизома пролифератор рецептор (PPAR) -γ, C/EBP-α, C/EBP-γ [22]. Въпреки това, неговите ефекти върху адипогенезата все още не са изследвани при животински модели.

В настоящото проучване ние провеждахме ежедневно перорално приложение на воден екстракт от АА при животински модел, предизвикан от затлъстяване (DIO). Екстракт от АА се прилага върху клетки 3T3-L1, след което относителните протеинови експресии се сравняват между различни концентрации и времена от приложението. В допълнение, оцветяването с маслено червено О и Western blot се извършват in vitro, след което се наблюдават физиологичните данни и ефектите върху адипогенезата въз основа на хистологията и експресията на mRNA на много свързани гени за оценка на ефектите срещу затлъстяването на билката AA в in vivo система.

Материали и методи

AA екстракция

Общо 40 g AA се кипват с 1,8 L дестилирана вода (DW) под 1,5 бара при 80 ℃. След кипене в продължение на 30 минути екстрактът беше напълно охладен. Екстрактът се филтрира първо от хартия (185 mm; Advantec, Япония), след това от Nalgene Rapid-Flow Battle Top Filter (0.2 µm-порна мембрана; Thermo Scientific, САЩ). Крайният екстракт от АА се съхранява при 4 ℃.

Животни

Двадесет и четири възрастни мишки C57BL/6J (средно = 23 g, между 21 и 25 g, на 7-седмична възраст) бяха настанени при стайна температура (22 ℃) и 60% влажност при 12-часова светлина: тъмен цикъл (светлина цикъл: тъмен цикъл от 07:00 до 19:00). Мишките бяха разделени на четири групи, две, които получиха нормална диета с чау (2018S; Харлан, САЩ) и две, които получиха диета с високо съдържание на мазнини (TD.06414; Харлан). Беше разрешен свободен достъп до вода. Всеки ден 10 ml/1 kg/ден AA екстракт се прилага внимателно с перорален зонд (0,9 × 50 mm) на половината от всяка група храни, докато същото количество DW се прилага на другата половина. Теглото, приема на храна и вода се записват ежедневно и нивото на кръвната захар се тества веднъж седмично при условия на гладуване. Периферната кръв се събира чрез прерязване на върха на вената на опашката на мишката. Нивата на глюкоза в периферната кръв бяха измерени с помощта на One Touch Ultra (LifeScan, USA) глюкомер с тестови ленти One Touch Ultra (LifeScan). Експериментите са проведени в продължение на 4 седмици и са одобрени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните (одобрение на IACUC № SCH15-0001) към университета Soonchunhyang.

Обработка на тъкани

Епидидималните мастни тъкани се отстраняват преди перфузия и се потапят в 4% параформалдехид (PFA). Животните бяха перфузирани с 0,1 М фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS; рН 7,35), последван от 4% PFA в 0,1 М фосфатен буфер (PB; рН 7,35).

Клетъчна култура

3T3-L1 клетки се поддържат в среда с високо съдържание на глюкоза (25 mM) Dulbecco's Modified Eagle (DMEM; Gibco, USA), допълнена с 10% говежди телешки серум (BCS; Hyclone, USA) и антибиотици (пеницилин 100 U/ml и стрептомицин 100 mg/mL) при 37 ℃ в 5% CO2 инкубатор. За диференциация на адипоцитите клетките бяха третирани с индуцираща диференциация среда (DIM), съдържаща 1 цМ дексаметазон (Sigma, САЩ), 5 mM 3-изобутил-1-метилксантин (Sigma) и 4 mg/ml инсулин (Sigma) в DMEM с 10 % фетален говежди серум (FBS) на 2 дни след сливането. След 2 дни клетките се култивират в DMEM, съдържащ 10% FBS и инсулин. Впоследствие средата се сменяше на всеки втори ден.

Маслено червено O оцветяване

Оцветяването с маслено червено О се извършва на адипогенна индукция в ден 8. Накратко, клетките се промиват два пъти с PBS, след това се фиксират с 4% параформалдехид за 1 h при стайна температура. Впоследствие клетките се измиват с 60% изопропанол и се изсушават напълно. И накрая, клетките се оцветяват с маслено червено О (6 части 0,5% маслено червено О на прах в изопропанол и 4 части вода) в продължение на 10 минути и се промиват с PBS.

Количествен PCR анализ в реално време

Общата РНК беше изолирана от епидидималната мастна тъкан, използвайки Ambion PureLink RNA Mini Kit, съгласно инструкциите на производителя (Ambion, САЩ). Количествената PCR в реално време се извършва с SYBR Green багрило, използвайки ABI Step One PCR инструмент в реално време (Applied Biosystems, UK). За относително количествено определяне на генната експресия използвахме сравнителния метод Ct (2 -ΔΔCt). Резултатите бяха нормализирани към контролния ген (36В4, домакински ген, киселинен рибозомен протеин). Последователностите на използваните праймери и сонди са изброени в Таблица 1 [13,17].

маса 1

ефект

Western blot анализ

Клетъчните екстракти се хомогенизират в лизисен буфер (iNtRon Biotechnology, Корея) и концентрациите на протеини се определят с BCA комплект (iNtRon Biotechnology). Лизатите се разделят с 10% SDS-PAGE и се прехвърлят в PVDF мембрани (Bio-Rad Laboratories, САЩ). Мембраните бяха сондирани с първични антитела срещу PPAR-γ, свързващ протеин 4 с мастни киселини (FabP4), глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа (Cell Signaling Technologies, САЩ) и C/EBPβ (Abcam, Великобритания), след това инкубирани за една нощ. След допълнително измиване, мембраните се инкубират с конюгирано с HRP вторично антитяло (Vector, САЩ). Имунореактивните сигнали бяха открити въз основа на тяхната засилена хемилуминесценция и записани в системата MicroChemi 4.2.

Анализ на данни

Всички измервания бяха извършени и анализирани, за да се гарантира обективност. Интензивността на лентите, генерирани по време на уестърн блотинг, беше оценена въз основа на оптичната плътност, измерена чрез трансформиране на средните нива на сивото, използвайки формулата: оптична плътност = log (256/средно ниво на сивото) със софтуера ImageJ 1.59 (National Institutes of Health, USA) Размерът на липидните капки се калибрира за експериментална област в микроскопа. Данните f са представени като средно ± стандартна грешка (SE). Относителните нива на експресия на иРНК се измерват автоматично чрез qPCR в реално време. Разликите между средните стойности бяха анализирани с помощта на повтарящ се двустранен дисперсионен анализ и еднопосочен дисперсионен анализ, последван от пост-теста на Bonferroni и новите множество методи за определяне на разликите между експерименталните групи.

Резултати

Физиологични данни

Резултатите показват, че и четирите групи мишки имат сходни тегла в началото на експеримента. Ежедневните измервания на теглото показват, че групата с високо съдържание на мазнини (HF)/AA тежи по-малко от групата с HF/превозно средство (Veh). Тази разлика е статистически значима от 14-ия ден и става по-очевидна с напредването на експеримента. И в двете групи, хранени с нормална чау-диета (ND), групата ND/AA тежи малко по-малко от ND/Veh, но тази разлика не е значителна (панел A и B на фиг. 1). Приемът на храна и в двете групи, хранени с ND (ND/Veh и ND/AA), не се различава значително по време на експеримента. През първите две седмици няма забележими разлики в приема на храна между групите, хранени с HF (HF/Veh и HF/AA), но приемът на храна в групата на HF/AA става относително по-нисък, отколкото в групата на HF/Veh след това (панел C и D на фиг. 1). Няма разлики в нивата на кръвната захар между групите. Епидидималните мастни тъкани на мишките, получили AA (ND и HF), са по-ниски от тези на мишки, които са получили Veh (ND и HF).