Джихао Джао

1 Институт по хранителни науки и технологии, Китайска академия на земеделските науки/Ключова лаборатория за преработка на агропродукти, Министерство на земеделието и селските въпроси, Пекин 100193, Китай; moc.361@1991oahihzoahz (Z.Z.); moc.361@2190_mas (A.S.)

Аймин Ши

1 Институт по хранителни науки и технологии, Китайска академия на земеделските науки/Ключова лаборатория за преработка на агропродукти, Министерство на земеделието и селските въпроси, Пекин 100193, Китай; moc.361@1991oahihzoahz (Z.Z.); moc.361@2190_mas (A.S.)

Qiang Wang

1 Институт по хранителни науки и технологии, Китайска академия на земеделските науки/Ключова лаборатория за преработка на агропродукти, Министерство на земеделието и селските въпроси, Пекин 100193, Китай; moc.361@1991oahihzoahz (Z.Z.); moc.361@2190_mas (A.S.)

Джинронг Джоу

2 Лаборатория за хранене/метаболизъм, Медицински център на Бет Израел за дяконеса, Медицинско училище в Харвард, 330 Brookline Avenue, Бостън, Масачузетс 02215, САЩ; ude.dravrah.cmdib@uohzrj

Свързани данни

Резюме

1. Въведение

Метаболитният синдром (МС), характеризиращ се с три или повече от петте медицински компонента (включително затлъстяване, хипергликемия, дислипидемия, хипертония и инсулинова резистентност), може да увеличи риска от диабет тип 2 (T2DM) и сърдечно-съдови заболявания (ССЗ) [1] . В сравнение с хората без МС, хората, страдащи от МС, са два пъти по-склонни да умрат и три пъти по-вероятно да получат инфаркт или инсулт. Разпространението на МС нараства в световен мащаб, особено в развиващите се страни, което се дължи главно на промените в начина на живот и диетите. Смята се, че около един на всеки четири души по света страда от МС [2]. Настоящото разпространение на МС сред възрастни китайци е 24,2%, което е рязък растеж в сравнение със стойността от 9,8%, изчислена преди 10 години при същия стандарт на диагноза [3,4]. По този начин разпространението на МС се превърна в сериозна заплаха за съвременното общество и нейните превантивни стратегии са значителни.

Голямо количество данни показват, че чревната микробиота е от съществено значение за поддържане на метаболитната хомеостаза на гостоприемника [5,6]. Голямо разнообразие от коменсални микроби колонизира лумена на червата. Например количеството популация на микроби в чревната микробиота е приблизително 10 пъти по-голямо от това на соматичните клетки в човешкото тяло. Тези микроби участват в повечето метаболитни дейности in vivo. Напоследък е доказано, че някои полезни видове или родове чревна микробиота са отрицателно свързани с развитието на МС, като Akkermansia [7], Bifidobacterium [5] и Lactobacillus [8]. За разлика от тях, свръхпролиферацията на някои провъзпалителни или патогенни чревни микробиоти, като Erysipelotrichaceae, Coriobacteriaceae и Streptococcaceae, са свързани с развитието на затлъстяване, системно възпаление и метаболитни нарушения както при хората, така и при гризачите [8,9,10 ]. По този начин регулирането на причиненото от диетите нарушаване на чревната микробиота е представено като потенциална цел за интервенция за профилактика на МС и свързаните с тях заболявания [11].

Вирджинският зехтин е основният източник на хранителни мазнини в основата на средиземноморската диета. Широко се признава връзката между редовната консумация на необработен зехтин и по-ниския риск от МС [23]. Тези полезни биологични дейности се дължат не само на високото съдържание на мононенаситени мастни киселини (MUFA), но и на незначителните биоактивни фитохимикали [24]. Последните изследвания показват възможността необработеното зехтин да отслаби МС, свързано с модулация на чревната микробиота [25]. По подобен начин, HOPO също е богат на MUFA (осигурява до 80% от състава на мастните киселини, подобно дори по-високо ниво на зехтина) и незначителни биоактивни фитохимикали, като полифенол, фитостероли и витамин Е и др. чревна микробиота модулиране на HOPO никога не е проучвано.

Следователно, в това проучване проведохме сравнение на ефектите на HOPO и EVOO добавка върху МС при плъхове, хранени с HFHFD. След това, за да се илюстрират възможните механизми, профилът на чревната микробиота се анализира чрез използване на техника за секвениране на 16S рРНК и се определят и биохимичните индекси. Демонстрирахме, че както HOPO, така и EVOO могат да отслабят индуцираната от HFHFD МС. Освен това, това проучване представя ново възприятие за модулация на чревната микробиота в превенцията на МС от хранителни мазнини, богати на MUFA.

2. Материали и методи

2.1. Материали

HOPO, предоставено от Luhua Group (Laiyang, Китай). EVOO, закупен от Mueloliva Co. Ltd. (Кордоба, Испания). Профилите на мастни киселини на HOPO и EVOO са показани в таблица S1. Фруктоза, закупена от SIWANG SUGAR Co. Ltd. (Binzhou, Китай).

2.2. Животни и лечение

48-те мъжки SD плъха на възраст 6 седмици са закупени от Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Пекин, Китай). След адаптивно хранене в продължение на 1 седмица, плъховете бяха разделени на случаен принцип в 4 групи (n = 12), за да получат съответно следните диети ad libitum в продължение на 12 седмици: (A) NC (нормален контрол, нормална чау диета + обикновена питейна вода); (B) M (модел, диета с високо съдържание на мазнини + питейна вода съдържа 10% фруктоза); (C) HOPO (диета с фъстъчено масло с високо съдържание на олеинова киселина, диета с високо съдържание на мазнини съдържа 10% HOPO + питейната вода съдържа 10% фруктоза); и (D) EVOO (диета с екстра върджин зехтин, диета с високо съдържание на мазнини съдържа 10% EVOO + питейната вода съдържа 10% фруктоза). Съставите на диетите са показани в таблица S2. Всички диети са закупени от Trophic Animal Feed High-Tech Co. Ltd. (Nantong, Китай). Плъховете се държат в добре проветриво помещение, поддържано при 23 ± 2 ° С с 12-часови цикли светлина-тъмнина. Теглото им и приемът на храна и вода се записват ежеседмично. Кръвната глюкоза на гладно, пероралният глюкозен толерантен тест (OGTT) и инсулиновият толерантен тест (ITT) бяха измерени на 0, 4, 8 и 12 седмици. Протоколи за проучвания върху животни бяха одобрени от институционалния комитет по грижа и употреба на животните от Пекинската лаборатория Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (VR IACUC, Пекин, Китай, № P2018036).

2.3. Оценка на инсулинова резистентност

Тест за орален толеранс към глюкоза (OGTT): плъховете се гладуват 12 часа и се влива перорално с глюкоза (2 g/kg). Кръвта се събира от опашната вена и нивото на глюкозата се измерва с глюкомер (Johnson and Johnson Investment, Co. Ltd., Шанхай, Китай) преди (0 минути) и след сонда (15, 30, 60, 90 и 120 минути) . Площта под кривата (AUC) беше изчислена, за да представи глюкозния толеранс. AUC се изчислява по формулата AUC = 0,25 × (G0 + G15)/2 + 0,25 × (G15 + G30)/2 + 0,5 × (G30 + G60)/2 + 0,5 × (G60 + G90)/2 + 0,5 × (G90 + G120)/2, където G0, G15, G30, G60, G90 и G120 са нива на глюкоза в кръвта в различни часови точки.

Тест за инсулинова толерантност (ITT): плъховете са гладували 12 часа и са получавали интраперитонеална инжекция на инсулинов разтвор (0,75 U/kg). Тестът за кръвна глюкоза и изчисляването на стойността на AUC бяха извършени както при OGTT. HOMA-IR се изчислява, като се използва формулата HOMA-IR = (FPG × FINS) /22,5, където FPG и FINS са на ниво глюкоза в кръвта на гладно и инсулин на гладно.

2.4. Биохимичен анализ на серума

В края на експеримента животните бяха умъртвени и бяха взети кръвни проби. Серумните проби се приготвят чрез центрофугиране (4 ° С, 2000 х g за 15 минути). Нивата на SerumTG, TC, липопротеини с ниска плътност (LDL), липопротеини с висока плътност (HDL), инсулин, свободна мастна киселина (FFA) и TNF-a са анализирани с помощта на комплекти от Инженерния институт по биоинженерство в Нанкин Jiancheng (Нанкин, Китай).

2.5. Хистопатологично изследване и ниво на TG в чернодробната тъкан

Прясно изолираните чернодробни тъкани се вграждат в съединение с оптимална температура на рязане (OCT) и се съхраняват при -80 ° C фризер за ултра-студено съхранение след замразяване. Чернодробните тъкани се нарязват на 8 μm участъци върху криостат и се фиксират с 4% параформалдехид за 10 минути. Срезите бяха оцветени с маслено червено О за 12 минути и пребоядисани с хематоксилин за 4 минути. Разрезите бяха наблюдавани под светлинен микроскоп (Primo star, Carl Zeiss Microscopy GmbH, Йена, Германия). Нивото на TG в чернодробната тъкан е анализирано с помощта на комплекти от Института по биоинженерство в Нанкин Jiancheng (Нанкин, Китай).

2.6. Анализ на чревната микробиота

След 12 седмици експериментално третиране, свежи фекални проби се събират в стерилизирани епруветки на Eppendorf и се съхраняват при -80 ° C фризер за ултра-студено съхранение след замразяване. Десет плъха бяха избрани на случаен принцип от всяка група за анализ на чревната микробиота. Съгласно инструкциите, Mini Kit за изпражнения на QIAamp от Qiagen (Hilden, Германия) се използва за извличане на бактериална геномна ДНК от замразени фекални проби, временно съхранявани при -80 ° C в продължение на 24 часа. Генът 16S рРНК, съдържащ региони V3 и V4, беше увеличен чрез PCR, използвайки композитни специфични бактериални праймери (Таблица S3). Термичното циклиране беше както следва: 95 ° C за 5 минути (1 цикъл), 95 ° C за 30 s/50 ° C за 30 s/72 ° C за 40 s (25 цикъла) и окончателно удължаване при 72 ° C за 7 минути. Пиросеквениране с висока производителност на PCR продуктите беше извършено на платформа Illumina MiSeq от Biomarker Technologies Co, Ltd. (Пекин, Китай).

киселина

Ефекти от лечението върху телесното тегло, наддаването на телесно тегло, енергийния прием и енергийната ефективност. Телесно тегло (A), наддаване на телесно тегло (Б.), енергиен прием (° С) и енергийна ефективност, изчислена като наддаване на телесно тегло/енергиен прием (д). Данните са изразени като средни стойности ± SD (n = 12 за всяка група). Различните букви представляват значителни разлики между различните групи (p Фигура 2 А, липидните капчици в чернодробните клетки са червени, а клетъчните ядра са сини в маслено червено Оцветяване. Чернодробните тъкани в NC група не показват значителни червени капчици или области. с NC група, чернодробните тъкани в М група показват по-голямо натрупване на мазнини. Въпреки това, в сравнение с М група, чернодробните тъкани в HOPO и EVOO групата показват по-малко натрупване на мазнини. Тази тенденция също съответства на резултата от нивото на TG в черния дроб. показано на Фигура 2 Б, нивата на чернодробния TG в групата HOPO и EVOO са значително по-ниски от групата М. Добавките на HOPO и EVOO драстично намаляват степента на индуцирана от HFHFD адипоза hepatica при плъхове с MS.

Данните са изразени като средни стойности ± SD (n = 12 за всяка група). Различните букви в един и същ ред представляват значителни разлики между различните групи (p Таблица 2, нивата на TC, TG и LDL на М групата са значително по-високи от NC групата (М група 3.62 ± 0.50, 5.99 ± 2.09 и 0.56 ± 0.21 mmol/L срещу NC група 3,00 ± 0,79, 1,95 ± 0,42 и 0,40 ± 0,14 mmol/L, p 0,05) .За нивото на HDL няма значителни разлики между никоя група (NC, M, HOPO и EVOO група: 0,84 ± 0,15, 0,71 ± 0,25, 0,69 ± 0,23 и 0,76 ± 0,25, съответно, p> 0,05) .За съотношението HDL/LDL, както HOPO, така и EVOO групата се увеличават от групата M, но по-малко от групата NC (NC, M, HOPO, и EVOO група: 2,10 ± 0,25, 1,27 ± 0,12, 1,82 ± 0,18 и 1,52 ± 0,21, съответно, p> 0,05). В сравнение с NC група, М групата показва значително увеличение на свободните мастни киселини и нивото на TNF-a (M група 555.80 ± 55.34 umol/L и 257.74 ± 75.73 pg/mL спрямо NC група 459.96 ± 38.76 umol/L и 196.11 ± 34.67 pg/mL, p 0.05). Тези резултати показват, че добавките с HOPO и EVOO могат да подобрят серумните липиди s профил при HFHFD-индуцирани MS плъхове и защитните ефекти на HOPO са по-добри от EVOO.

Таблица 2

Ефекти от лечението върху биомаркери на метаболитен синдром в серума.

NCMHOPOEVOO
TC (mmol/L)3,00 ± 0,79 a 3.62 ± 0.50 b 3,06 ± 0,65 a 3,18 ± 0,40 ab
TG (mmol/L)1,95 ± 0,42 a 5,99 ± 2,09 c 4,23 ± 1,45 b 5,79 ± 2,22 c
HDL (mmol/L)0,84 ± 0,15 a 0,71 ± 0,25 a 0,69 ± 0,23 a 0,76 ± 0,25 a
LDL (mmol/L)0,40 ± 0,14 а 0,56 ± 0,21 b 0,38 ± 0,13 a 0,50 ± 0,18 ab
HDL/LDL2,10 ± 0,25 c 1,27 ± 0,12 a 1,82 ± 0,18 b 1,52 ± 0,21 b
FFA (umol/L)459,96 ± 38,76 a 555.80 ± 55.34 b 526,80 ± 60,18 b 512,06 ± 47,15 b
TNF-a (ug/ml)196,11 ± 34,67 а 257,74 ± 75,73 b 208,16 ± 58,73 ab 220,35 ± 63,03 ab

Данните са изразени като средни стойности ± SD (n = 12 за всяка група). Различните букви в един ред представляват значителни разлики между различните групи (p Фигура 3 А). HOPO и EVOO значително увеличиха β-разнообразието на чревния микробиотен състав. На ниво фила, Firmicutes, Bacteroidetes и Actinobacteria бяха доминиращата фила във всички групи (Фигура 3 Б). Съотношенията F/B на три HFHFD групи са по-високи от NC групата, а HOPO и EVOO групата са по-високи от M групата, въпреки че затлъстяването и серумните параметри, отслабени от HOPO и EVOO добавки (NC, M, HOPO и EVOO група: 5.65, 9.41, 14.39 и 12.91, съответно, Фигура 3 Б). Анализите на PCA, NMDS и топлинните карти показват степени на сходство на чревната микробиота в четири групи. Диаграмите на разсейване на PCA и NMDS показват, че точките от четири групи са ясно разграничени, по-специално между NC и три HFHFD групи (Фигура 3 C, D). Топлинните карти показват, че HOPO, EVOO и NC са по-сходни от NC с M, а HOPO е по-сходен с NC, отколкото EVOO (Фигура 3 E, F). Тази тенденция също беше в съответствие с разсейващите диаграми на PCA и NMDS. Взети заедно, добавките HOPO и EVOO намаляват дисбаланса на чревната микробиота, индуциран от HFHFD.

Резултатите от анализа на размера на ефекта на линейния дискриминант (LDA) (LEfSe) и чревната микробиота на ниво семейство и род със значителна разлика (n = 10 за всяка група). LEfSe анализ (A), Семейно ниво (Б.) и род (° С) със значителна разлика. На ниво род са изброени само видовете, които имат относително изобилие над 0,1%. NC: нормална контролна група, M: моделна група, HOPO: група с фъстъчено масло с високо съдържание на олеинова киселина, EVOO: група екстра върджин зехтин.

Анализът на метастатици е използван за скрининг на видовете, причиняващи разликата в състава на двете групи. На семейни нива, видове със значителна разлика между M група срещу NC група, HOPO група срещу M група и EVOO група срещу M група са показани на Фигура 4 B (p Фигура 4 C (p 0.1%). В сравнение с NC група, М група е значително увеличен, Acinetobacter, Bilophila, Aerococcus, Ruminococcaceae_UCG-003, Coprococcus_1, Staphylococcus, uncultured_bacterium_f_Coriobacteriaceae, Klebsiella, Escherichia-Shigella, Acinetobacter, Ruminiclostridium_9, Enterococcus, Roseburia, Corynebacterium_1 [Ruminococcus] _torques_group и Lachnoclostridium (р (201K, pdf)

Принос на автора

Концептуализация, Q.W. и J.Z .; методология, Z.Z., A.S. и J.Z .; разследване, З.З. и като.; куриране на данни: Q.W., Z.Z., A.S. и J.Z .; писане - изготвяне на оригинален проект, Z.Z. и като.; писане - преглед и редакция, всички автори.

Финансиране

Това изследване е финансирано от Програмата за селскостопански науки и технологии на Китайската академия на земеделските науки, номер на безвъзмездна помощ CAAS-ASTIP-201X-IAPPST, Националната научна фондация на Китай, номер на безвъзмездна помощ 31701545 и Програма за спонсорство на млади елитни учени от Китай Асоциация за наука и технологии, грант номер 2018QNRC001.

Конфликт на интереси

Авторите не декларират конфликт на интереси.