Катедра по биомедицина, Медицински факултет, Университет в Порто.

върху

Професор Аламеда Хернани Монтейро; 4200-319 Порто, (Португалия)

Тел. +351 225513616, факс +351 225513617, имейл [email protected]

Сродни статии за „“

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • електронна поща

Резюме

Въведение

Бъбреците играят неразделна роля в регулирането на кръвното налягане (BP) и дори най-малкото увреждане на бъбречната функция може да допринесе за развитието на хипертония [1, 2], която остава водеща причина за заболеваемост и смъртност в световен мащаб [3]. Сред модифицируемите рискови фактори за развитие на хипертония, консумацията на тежък етанол се счита за един от най-важните модели на нездравословен начин на живот [3, 4], а данните от епидемиологични, клинични и експериментални проучвания осигуряват убедителна връзка между тези две състояния [ 4-10]. Въпреки че е широко известно, че тежката консумация на етанол има хипертонични ефекти [4-13] и може да предизвика увреждане на няколко органа [6, 10-16], неговите ефекти върху бъбречната структура и функция остават да бъдат изяснени [16-18]. Освен това много малко клинични и експериментални проучвания оценяват измененията на АН, които са в основата на спирането на алкохола и особено след острото отнемане [19, 20], но няма последващи проучвания при липса на консумация на алкохол, по-специално неговите последици върху АН и бъбречната структура.

Хроничната консумация на етанол повишава АН чрез различни механизми [5, 8, 11, 12], включително активиране на ренин-ангиотензиновата система (RAS) [11, 21, 22], оксидативен стрес [11, 12, 18, 21-23 ] и засилване на активността на симпатиковия нерв [5]. Повечето от предизвиканите от ангиотензин II (Ang II) ефекти се медиират от Ang II тип 1 рецептор (AT1R) [21, 22, 24, 25], като повишаване на системния BP, вазоконстрикция, инхибиране на бъбречната симпатикова нервна активност, контрол на барорецепторите, гломерулна хипертония и задържане на натрий и телесни течности [22, 24-26]. Освен това има доказателства, че патологичното активиране на интрареналния RAS засилва оксидативния стрес [2, 27, 28] и насърчава увреждането на бъбреците, а именно на гломерулите, тубулите и васкулатурата [22, 24, 28]. Данните относно ефектите от консумацията на етанол върху бъбречната структура и функция са разнопосочни, вероятно поради разликите в количеството консумиран етанол в няколко проучвания [6, 15-17, 29]. Възможно е, наред със системните хипертонични ефекти, тежката консумация на етанол също да наруши структурата и функцията на бъбреците, поради което да допринесе за поддържането на хипертонията.

Тази работа изучава въздействието на продължителната консумация на тежък етанол върху АН, морфологията на бъбреците и върху експресията на AT1R. Освен това оценихме дали оттеглянето е успяло да върне тези ефекти. Доколкото ни е известно, това е първото проспективно проучване при животни, което изследва дали физиологичните и структурни промени в бъбреците поради хронична консумация на алкохол продължават след 2 месеца след отнемането. Тази последваща оценка може да предложи значителна възможност за подобряване на нашето разбиране за перспективата за сърдечно-съдова коморбидност, свързана с продължителната консумация на тежък етанол.

Материали и методи

Експериментални животни

Фиг. 1.

Схематичен чертеж на времевата линия на експерименталния дизайн. Проучването започва с две групи плъхове: контрола-8 m, бяла колона и етанол, черна колона и продължава 6 месеца. По това време (S1) половината от животните от всяка група са били жертвоприношения. Останалите животни продължиха проучването, цялата питейна вода (контролна група от 10 m, бяла колона и група за изтегляне, квадратна колона) и бяха жертвани два месеца по-късно (S2). Тъй като данните от control-8m и control-10m не се различават, и двете контролни групи бяха нанесени заедно. Прекъснатите линии представляват моментите за определяне на концентрациите на етанол в кръвта. Засенчените колони представляват трите седмици на определяне на АН (1 седмица за подготовка и две седмици за запис).

Всички процедури бяха проведени в съответствие с насоките на Съвета на Европейските общности в областта на изследванията върху животни (2010/63/EU) и португалския закон 113/13 и одобрени от Комитета за преглед на етиката за хуманно отношение към животните (ORBEA) на Медицинския факултет на Университета в Порто.

Измервания на кръвното налягане и биохимия на кръвта

Диастолното, систоличното и средното артериално кръвно налягане се измерват с помощта на системата за кръвно налягане CODA опашка (Kent Scientific Corporation, Кънектикът, САЩ). Животните бяха подложени на адаптационен период в продължение на една седмица преди измерванията. Измерванията на АН са записани през последните две седмици на етанол и отнемане [14].

Кръвни проби (500 μl) се събират веднъж месечно след 2 часа светлинно компенсиране и светлина, директно в епруветките на Eppendorf за измерване на концентрациите на етанол в кръвта. В края на експерименталния период кръвта се събира директно от лявата камера с хепаринизирани игли, центрофугира се два пъти при 2000 rpm за 10 минути и серумът се събира и съхранява при –80 ° C. Концентрациите на алкохол в кръвта се измерват с помощта на търговски комплект (K620-100; BioVision, Mountain View, Калифорния, САЩ). Стойностите на концентрацията на етанол в кръвта са представени като средна стойност за всички месечни определяния. Количествените нива на серумен креатинин, пикочна киселина, урея и албумин се определят с помощта на автоматизиран химически анализатор PRESTIGE 24i®. Резултатите от нивата на серумен креатинин, пикочна киселина и урея се изразяват в mg/dl, а нивата на серумен албумин се изразяват в g ​​/ dl.

Истоморфология и имунохистохимия

В края на експерименталния период плъхове (н = 6 на група) се анестезират с разтвор на натриев пентобарбитал (80 mg/kg телесно тегло; i.p. инжекция, Abbott; Северно Чикаго, IL) и се перфузират транскардиално с 4% параформалдехид във фосфатен буфер. Бъбреците се отстраняват, претеглят и съхраняват в същия фиксиращ разтвор.

Хистоморфологията на бъбречните гломерули беше анализирана в оцветени с PAS участъци. Фракцията на бъбречната кора, заета от гломерули (Vv), беше определена с помощта на система за преброяване на точки [37], при 400-кратно увеличение на нивото на монитора. Във всяка секция зрителните полета бяха систематично взети проби на равни интервали от 2000 µm по оста x и оста y; площта на преброяващата рамка беше 511 mm 2. Ареалната плътност (NA) на бъбречните гломерули е оценена в същите зрителни полета, използвани за оценки на Vv. Площта на тубата на гломерулния профил и на бъбречното тяло е измерена чрез преброяване на точки [37], при 800 × увеличение на нивото на монитора. Измервани са петдесет гломерули на бъбрек.

Уестърн блот метод

За биохимични анализи, плъхове (н = 4 на група) са евтаназирани с приложение на пентобарбитал в края на експерименталния протокол. Бъбреците се събират и съхраняват при –80 ° C за по-късна обработка.

Екстракцията на протеини и определянето на концентрацията на протеини се извършват, както е описано по-рано [14], като се използват цели бъбречни хомогенати. Имуноблотинг се извършва със същото заешко анти-AT1R антитяло при разреждане 1: 500 и миши анти-α-тубулин (T6199, RRID: AB_477583; Sigma-Aldrich, Мадрид, Испания) при разреждане 1: 1000, последвано от инкубация с анти- заек (Sigma-Aldrich, Мадрид, Испания) и антимиши (Vector Laboratories, Burlingame, CA) вторични антитела, конюгирани с хрянова пероксидаза при разреждане 1: 1000. Сигналите се визуализират със субстрата Chemi-lumi (Chemidoc MP, Bio-Rad Laboratories). Оптичната плътност на лентите беше измерена с помощта на софтуера Image Lab (Bio-Rad Laboratories) и количествено определена чрез денситометрия, използвайки експресия на α-тубулин като ендогенен контрол за нормализиране.

Статистически анализ

Сравненията между групите бяха извършени чрез еднопосочен ANOVA с лечение като независима променлива. Винаги, когато бяха открити значителни резултати, се правеха сравнения по двойки с post hoc тест на Tukey, използвайки GraphPad PRISM версия 6.0 (Сан Диего, Калифорния, САЩ). Серумните нива и измерванията на кръвното налягане са представени като средни стойности ± SEM. Останалите резултати са представени като средни стойности ± SD. Счита се, че разликите са статистически значими, ако стр * p ** p # p ## p-ия ден на приложение на етанол (при 5% във вода). Измерванията през месец = 1 включват периода на адаптация на етанола. Измерванията през месец = 7 включват постепенния карентен период на етанол. Определянето на приема на течности в групата на ЕТ от 2-ри до 6-ти месец съответства на приема на етанол (20%). На месец = 6, половината от плъховете С и ЕТ бяха умъртвени (n = 10 в група ET и n = 5 в група C). В края на изследването останалите плъхове бяха умъртвени (n = 10 в W група и n = 5 в C група).

Количеството храна и течност, погълнати от третирани с етанол плъхове, намалява съответно с около 45% и 35% от приема на храна и вода от контролите през първия месец от третирането с етанол и след това остава относително стабилно (Фиг. 2В и С ). След оттеглянето, количеството консумирана храна и течност се връща приблизително към консумираното от контролните плъхове.

Лечението оказа значителен ефект върху абсолютното и относителното тегло на бъбреците (стр * p ** p # p ## p * p ** p # p ## p * p ** p *** p * p # p