L Liu

1 Катедра по човешко хранене, храни и упражнения, Fralin Life Science Institute, College of Agriculture and Life Science, Virginia Tech, Blacksburg, VA, USA

P Zou

1 Катедра по човешко хранене, храни и упражнения, Fralin Life Science Institute, College of Agriculture and Life Science, Virginia Tech, Blacksburg, VA, USA

L Zheng

1 Катедра по човешко хранене, храни и упражнения, Fralin Life Science Institute, College of Agriculture and Life Science, Virginia Tech, Blacksburg, VA, USA

L E Linarelli

1 Катедра по човешко хранене, храни и упражнения, Fralin Life Science Institute, College of Agriculture and Life Science, Virginia Tech, Blacksburg, VA, USA

S Amarell

1 Катедра по човешко хранене, храни и упражнения, Fralin Life Science Institute, College of Agriculture and Life Science, Virginia Tech, Blacksburg, VA, USA

Пасаро

1 Катедра по човешко хранене, храни и упражнения, Fralin Life Science Institute, College of Agriculture and Life Science, Virginia Tech, Blacksburg, VA, USA

D Liu

1 Катедра по човешко хранене, храни и упражнения, Fralin Life Science Institute, College of Agriculture and Life Science, Virginia Tech, Blacksburg, VA, USA

Z Cheng

1 Катедра по човешко хранене, храни и упражнения, Fralin Life Science Institute, College of Agriculture and Life Science, Virginia Tech, Blacksburg, VA, USA

Свързани данни

Резюме

За да се разбере молекулярният механизъм на развитието на затлъстяването, са създадени различни модели на гризачи, които изследват печалбата или загубата на функции на различни гени. 6, 7 За тази цел системата за специфична рекомбинация Cre/lox е гъвкава, за да генерира условни миши мутанти, контролирайки генната експресия и активност в прицелните тъкани. 8, 9 По-специално, Тамоксифен (Tam) се използва за активиране на Cre рекомбинази пространствено-времево in vivo чрез интраперитонеално (I.P.) или подкожно приложение. 10, 11, 12 Инжектирането на Tam в доза 1–8 mg/kg телесно тегло в продължение на 5 последователни дни изтрива целевите гени, като по този начин създава гъвкава система за изследване на функционални гени при затлъстяване. 8, 9, 10, 11, 12

Резултати

Tam-индуцирано намаляване на мастната маса при мишки

За да тестваме ефекта на Tam върху мастната маса, проведохме 5-дневен I.P. приложение на Tam (1 mg/20 g телесно тегло) върху вилична кутия O1 (FoxO1) флоксирани мишки, които не носят Cre рекомбиназа (f-FoxO1), 15, 16, 17, следвайки стандартен протокол, установен по-рано. 12 Две седмици след приложението на Tam, телесните мазнини бяха намалени с 34% (P Фигура 1а). За да потвърдим констатациите, третирахме инсулинов рецепторен субстрат 1 (Irs1) и Irs2 двойно флоксирани мишки без Cre рекомбиназа (df-Irs) по подобен начин, 15, 16 и установихме, че мастната маса също е значително намалена (26%, P Фигура 1b; Допълнителна фигура S1B). Мониторингът на кинетиката на промяната на мастната маса предполага, че намаляването е продължило до 5-та седмица (4-та седмица при df-Irs мишки), след което процентът на мазнини е сравним с предварителните обработки (Фигура 1а; Допълнителна Фигура S1A). В съответствие с тази констатация, теглото на епидидимална бяла мастна тъкан (eWAT) е значително намалено при третирани с Tam мишки f-FoxO1 на седмица 2, докато няма значителна разлика на седмица 6 (Фигури 1в и г). За разлика от това, инжектирането на превозното средство е причинило неразличима промяна в телесната мастна маса (Фигура 1а; Допълнителна Фигура S1A). Следователно намаляването на мастната маса при мишките възниква главно от лечението с Tam. Като се има предвид, че и двата модела на мишки споделят този фенотип, ние използвахме f-FoxO1 мишки за следващото механистично проучване.

маса

Механизмът, чрез който Там намалява мастната маса, включва няколко клетъчни събития. Там лечението увеличава апоптозата и автофагията, процесите, които намаляват броя на адипоцитите и са замесени в мастната регулация. 2, 18, 19, 20, 21, 22, 23 Всъщност, клетъчната плътност и популацията на зрели адипоцити намаляват след лечение с Tam. Там също насърчава дедиференциацията на адипоцитите и производството на ROS, докато нормализирането на нивото на ROS значително смекчава индуцираната от Tam дедиференциация на адипоцитите, апоптозата и автофагията, едновременно с възстановяване на зряла популация на адипоцитите и мастна маса. Заедно, нашите данни категорично предполагат, че краткосрочното (5-дневно) лечение с Tam намалява мастната маса чрез увеличаване на производството на ROS.

Показано е, че Tam индуцира ROS и оксидативен стрес в раковите клетки на гърдата, хепатобластома клетките, клетките на ретината и тромбоцитите чрез активиране на NAD (P) H оксидаза, ензима, който също насърчава производството на ROS в макрофаги. 32, 42, 43, 44, 45, 46 ROS-усилващият ефект на Tam беше разширен и допълнително потвърден от нашето проучване в адипоцитите и мастните тъкани. Важно е, че установихме, че повишаването на ROS води до понижаване на регулацията на PPARγ и дедиференциране на адипоцитите, които подкрепят схващането, че зрелите адипоцити се подлагат на дедиференциация при условия на стрес. 34, 35 Показано е, че провъзпалителните адипоцитокини (напр. TNFa) могат да насърчат дедиференциацията на адипоцитите чрез понижаване на регулирането на PPARy. 34, 35 Като се има предвид, че повишаването на ROS или оксидативният стрес увеличава производството на TNFα, 47 Tam може да насърчи дедиференциацията на адипоцитите чрез активиране на оста ROS – TNFα – PPARγ. За тази цел инфилтрацията на макрофаги в мастната тъкан може да има роля, тъй като е показано, че тези фагоцити стимулират производството на ROS и TNFα, а също така реагират чувствително на ROS- и TNFα-медиирани сигнални каскади. 46, 48

Ефектът на Tam върху мастната маса при хората, например пациенти с рак на гърдата, остава неубедителен. Въпреки че Tam се съобщава за увеличаване на мастната маса чрез антиестрогенен ефект, 13 скорошни проучвания разхлабиха заключението, като показаха, че Tam няма ефект върху мастната маса при пациенти с рак на гърдата. 14 Трябва да се отбележи, че дозировката и продължителността на лечението на Tam за мишки в това проучване значително се различават от тази при дългосрочното лечение с Tam на пациенти с рак на гърдата. За да се активира Cre рекомбиназа за унищожаване на целеви гени, животинските модели обикновено се третират в продължение на 5 последователни дни (приложение на 1–8 mg/20 g телесно тегло или 50–400 mg/kg телесно тегло, веднъж на ден). 8, 9, 10, 11, 12 Въпреки това, терапията с Tam за пациенти с рак на гърдата в Съединените щати обикновено продължава 5 години, като доза от 20 mg (или една таблетка от 20 mg или две таблетки от 10 mg) се приема всеки месец веднъж дневно . 49, 50, 51 Ако приемем, че телесното тегло на пациентите с рак на гърдата варира от 50 kg до 80 kg, средната дневна употреба на Tam ще бъде 0,25–0,4 mg/kg, като дозата е 0,06–0,8% от използваната при животински модели . Поради различна дозировка и продължителност на лечението, ефектът на Tam върху масата на мастните мазнини, наблюдаван в това проучване, може да не бъде фенокопиран при пациенти с рак на гърдата с терапия с Tam.

Материали и методи

Материали

Модифицираната среда на Dulbecco Eagle's (DMEM) е от Corning Inc. (Manassas, VA, USA). Фетален говежди серум (FBS) е от GeneMate (Kaysville, UT, USA). Дексаметазон, 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX), розиглитазон и Tam са закупени от Cayman chemical (Ann Arbor, MI, USA). Пеницилин/стрептомицин (P/S) е от GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories (Logan, UT, USA). Инсулинът и NAC бяха от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Буферираният с фосфат физиологичен разтвор (PBS) е от Caisson Laboratories, Inc. (North Logan, UT, USA).

Флоксираните мишки FoxO1 (f-FoxO1) и Irs1/Irs2 двойно флоксирани мишки (df-Irs) бяха отгледани и настанени, както беше описано по-горе. 15, 16, 52 Накратко, мишките бяха настанени в пластмасови клетки на 12-часов фото-цикъл светло-тъмно, със свободен достъп до вода и редовна диета с чау. Преди експериментите за лечение с Tam, мъжки мишки (на възраст 14-16 седмици) бяха претеглени и масата на мазнините беше измерена с Brumer Minispec LF90 NMR анализатор (Bruker Optics, Billerica, MA, USA). След това мишките бяха преместени в стая за ниво на биобезопасност 2 (BSL2) и приложени с Tam (1 mg/20 g телесно тегло) или носителя (слънчогледово масло) от I.P. инжекция (веднъж дневно в продължение на 5 последователни дни). След приложението на Tam клетките се сменят на всеки 2 дни до седмица 2, когато мишките се прехвърлят в стая BSL1 и измерването на телесната мастна маса се възобновява. В зависимост от експерименталния дизайн, мишките са претеглени и умъртвени, за да съберат тъкани за бързо замразяване в течен азот, на седмица 2 или седмица 6 след третирането с Tam. Всички процедури следваха насоките на NIH и бяха одобрени от институционалния комитет по грижа и употреба на животните във Вирджиния.

Клетъчна култура и лечение

ROS измерване

ROS в адипоцитите и мастната тъкан е измерен, както е описано по-рано, 54, 55 с пропускливо за клетките багрило 5,6-карбокси-2 ', 7'-дихлорфлуоресцеин диацетат (Carboxy-DCFDA, Molecular Probes, Grand Island, NY, USA) . Замразените на място мастни тъкани се претеглят и прехвърлят в буферирана среда (5 mmol/l HEPES в PBS) за бързо размразяване за подобряване на дифузията на сондата. След бързо размразяване средата се изхвърля. Пробите бяха изложени на 8 μM Carboxy-DCFDA в прясна среда и бяха инкубирани при 37 ° С в продължение на 45 минути при разбъркване. След това средата беше отстранена и пробите бяха допълнително инкубирани в лизисен буфер (0.1% SDS, Tris-HCI, рН 7.4) в продължение на 15 минути при 4 ° С. След хомогенизиране пробите се центрофугират при 16 000 × g в продължение на 20 минути при 4 ° С. Супернатантите бяха събрани и подложени на флуоресцентен анализ при 530 nm при възбуждане при 485 nm с помощта на Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA).

За измерване на ROS в 3T3L1 адипоцити, 1–5 × 106 клетки се събират с типсин и се промиват три пъти със студен PBS, последвано от инкубация с 8 μM Carboxy-DCFDA в прясна среда (5 mmol/l HEPES в PBS) и се инкубират при 37 ° С в продължение на 45 минути при разбъркване. След това средата беше отстранена и пробите бяха допълнително инкубирани в PLC лизисен буфер: 15, 52 (30 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10% глицерол, 1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10 mM NaPPi, 100 mM NaF, 1 mM Na3VO4), допълнен с коктейл от инхибитор на протеаза (Roche, Branchburg, NJ, USA) и 1 mM PMSF за 15 минути при 4 ° C. След хомогенизиране пробите се центрофугират при 16 000 × g в продължение на 20 минути при 4 ° С. Супернатантите се събират и се подлагат на флуоресцентен анализ при 530 nm при възбуждане при 485 nm и общият протеин се определя с помощта на DC протеинов анализ (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) върху Synergy H4 Multi-Mode Microplate Reader (BioTek Инструменти, Inc.). Нивата на ROS бяха нормализирани до общия протеин за всяка клетъчна чиния.

Уестърн блотинг

За приготвяне на тъканни лизати, замразените мастни тъкани се претеглят и хомогенизират с Bullet Blender (Next Advance, Averill Park, NY, USA) в PLC буфер за лизис, допълнен с коктейл за инхибитор на протеаза (Roche), 1 mM PMSF, 10 μM TSA ( Trichostatin A, Selleckchem, Houston, TX, USA) и 5 ​​mM никотинамид (Alfa Aesar, Ward Hill, MA, USA). 15, 52 За клетъчните лизати 3T3L1 адипоцитите се промиват с ледено студен PBS и се хомогенизират с Bullet Blender. Общите протеинови концентрации на лизатите се определят с помощта на DC протеинов анализ (Bio-Rad). Уестърн блотинг и анализ на изображението бяха проведени, както е описано по-горе. 15 Каталожни номера и доставчици на антитела са както следва: разцепена каспаза-3 Rabbit mAb (9664) и LC3B антитяло (№ 2775) от Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA); PPAR-гама антитяло (MA5-14889) и GAPDH антитяло (MA5-15738) от Pierce (Rockford, IL, USA) или Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA); и HO1 антитяло (3391-100) от Biovision (Milpitas, Калифорния, САЩ).