Резюме

метаболитният синдром, който се характеризира с натрупване на затлъстяване, дислипидемия, хипергликемия и хипертония, е основен проблем на общественото здраве (1, 9, 10, 31). Наскоро няколко проучвания показаха, че пациентите с метаболитен синдром са изложени на висок риск от хронично бъбречно заболяване (ХБН) (7, 29, 32, 33). ХБН също се очертава като важна заплаха за здравето, тъй като е не само предиктор за прогресията до терминална бъбречна недостатъчност, но и независим рисков фактор за сърдечно-съдова смъртност (14, 16, 22, 30). Интересното е, че метаболитният синдром и ХБН носят множество често срещани рискови фактори за сърдечно-съдови заболявания. Съобщава се за допълнително повишен риск от сърдечно-съдови заболявания при пациенти с метаболитен синдром и ХБН, въпреки че всеки от тях е независим риск за сърдечно-съдови заболявания (19). Следователно профилактиката на ХБН, свързана с метаболитен синдром, е важна за подобряване на резултатите при пациенти с този синдром. За да се разработи стратегия за предотвратяване на ХБН при тези пациенти, изглежда важно да се изяснят бъбречните промени в метаболитния синдром, както и системните аномалии. Те обаче не са напълно оценени и механизмите, чрез които метаболитният синдром може да инициира и обостри ХБН, остават неуловими и до голяма степен спекулативни.

Животни.

Анализ на кръв и урина.

Триглицеридите (TG), общият холестерол и нестерифицираната мастна киселина (NEFA) се измерват с помощта на L тип TG H комплект, комплект за холестерол E-тест и NEFA C-тест комплект (Wako Chemicals, Осака, Япония). Плазменият инсулин се определя с помощта на ELISA комплект (Morinaga Institute of Biological Science, Токио, Япония). Адипонектинът в плазмата се определя със специфичен за мишки комплект ELISA (Otsuka Pharmaceutical, Токио, Япония). Хемоглобинът А1с (HbA1c) се измерва с помощта на анализатора DCA 2000 (Siemens Medical Solutions Diagnostics, Токио, Япония). Концентрацията на албумин в урината се измерва с комплект ELISA (Exocell, Philadelphia, PA), а ОАЕ се изразява като общо количество, екскретирано в 24-часово събиране на урина. За да се определи окислителното увреждане на ДНК, 24-часовото ниво на 8-хидрокси-2′-дезоксигуанозин в урината (8-OH-dG) беше определено с помощта на състезателен ELISA комплект (8-OH-dG Check, Институт за контрол на стареенето), Shizuoka, Япония).

Коремна компютърна томография.

Мишките във всяка диетична група бяха анестезирани чрез интраперитонеално инжектиране на натриев пентобарбитал и след това беше извършена компютърна томография на коремната кухина (LCT100A; AcroBio, Токио, Япония).

Морфологичен анализ и имунохистохимия.

Електронно микроскопско изследване.

Мишки на LFD и HFD на седмица 12 от експерименталния период са анестезирани чрез интраперитонеално инжектиране на пентобарбитал натрий. Бъбреците се перфузират с 0,1 mol/l фосфатен буфер и след това се отстраняват, нарязват се на малки тъканни блокове (1 mm 3) и се фиксират в 2,0% глуталдехид и 2,0% параформалдехид с 0,1 mol/l фосфатен буфер при 4 ° C. След постфиксация с 2% осмиев тетроксид, тъканите бяха дехидратирани в серия от степенувани етанолови препарати, заместващи етанола с пропиленовия оксид и вградени в епоксидна смола. Ултратънките секции бяха двукратно оцветени с уранил ацетат и олово. Разрезите бяха изследвани с електронна микроскопия JEM1200EX (JOEL, Токио, Япония) при 80 kV.

Имунофлуоресцентно изобразяване и оцветяване с маслено червено О.

За да се оцени натрупването на извънклетъчен матрикс (ECM), се извършва оцветяване с имунофлуоресценция със заешко антимиши тип IV колагеново антитяло (Chemicon, Temecula, СА). Замразените срезове бяха фиксирани с 10% формалин в PBS за 10 минути и предварително инкубирани с 2% BSA в PBS за 10 минути при стайна температура. След това те бяха покрити за една нощ при 4 ° С с колаген антитяло тип IV (разредено 1: 200) в преинкубационния разтвор. Секциите бяха изплакнати три пъти с PBS, инкубирани с 2% кози серум в 2% BSA в PBS при стайна температура и инкубирани в продължение на 1 h при 4 ° C с вторичното антитяло, конюгирано с родамин козе анти заешко IgG антитяло (разредено) 1: 100, MP Biomedicals, Solon, OH). След изплакване с PBS, секциите бяха монтирани с помощта на монтажна среда. След това бъбречните секции бяха изобразени с флуоресцентен микроскоп (BX61, Olympus, Tokyo, Japan). Замразените секции бяха използвани и за оцветяване с маслено червено О, чрез което беше оценено бъбречното натрупване на неутрални липиди, както беше съобщено по-рано (42).

Екстракция на РНК и количествена PCR в реално време.

Общата РНК е изолирана от целия бъбрек въз основа на протокола TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). cDNA беше синтезирана с помощта на реагенти за обратна транскрипция (Takara Bio, Otsu, Япония). iQSYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) беше използван за PCR в реално време (ABI Prime TM 7500 Sequence Detection System, PerkinElmer Applied Biosystems, Foster City, CA). Нивата на експресия на иРНК се определят количествено, използвайки метода на стандартната крива. Стандартните криви бяха конструирани с помощта на серийно разреден стандартен шаблон. Стойностите на Ct бяха използвани за изчисляване на нивата на експресия на иРНК от стандартната крива. Аналитичните данни бяха коригирани с нивата на експресия на иРНК на β-актин като вътрешен контрол. Последователността на праймерите беше следната: β-актин (напред) tggatgccacaggattccat, (обратен) cgtgcgtgacatcaaagagaa; ренин (напред) atgaagggggtgtctgtggggtc, (обратен) atgtcggggagggtgggcacctg; ангиотензин-конвертиращ ензим (ACE) (напред) tgagaaaagcacggaggtatcc, (обратен) agagttttgaaagttgctcacatca и аниготензиноген (напред) tcaaagcaggagaggaggaa, (обратен) cgtagatggcgaacaggaag.

Проучване за остро натоварване със сол.

Да се ​​изследва екскрецията на натрий в урината в отговор на остро натоварване на сол при мишки или с HFD или LFD при седмица 12 от експерименталния период се извършва зареждане със сол, както беше съобщено по-рано (13). След гладуване в продължение на 12 часа, мишките получават 1,5 ml 0,9% физиологичен разтвор интраперитонеално и се поставят в метаболитни клетки. Впоследствие урината се събира на час за следващите 6 часа и се измерва обемът на урината и екскрецията на натрий в урината.

Дългосрочно проучване на натоварването със сол.

За да тестваме дали дългосрочният висок прием на сол влияе върху кръвното налягане при мишките с HFD, извършихме 4-седмично зареждане със сол, използвайки мишките или с HFD, или с LFD. След като мишките се поддържат на която и да е диета (съдържаща по равно 0,1% NaCl във всяка диета) с чешмяна вода в продължение на 8 седмици, както е описано по-горе, те се поддържат при високо натоварване на сол с всяка диета чрез заместване на чешмяна вода с 1% физиологичен разтвор за 4 седмица, от седмица 9 да се седмица 12 от експерименталния период. Кръвното налягане се измерва преди и след натоварването на солта и се анализира промяната в систолното кръвно налягане. Индексът на чувствителност към солта се определя като реципрочен наклона на кривата налягане-натриуреза. Изградена е крива налягане-натриуреза чрез начертаване на 24-часовата екскреция на натрий в урината, нормализирана до 24-часовата екскреция на креатинин в урината и систолното кръвно налягане (24, 46).

Статистически анализ.

Резултатите са изразени като средни стойности ± SE. Еднопосочната ANOVA, последвана от теста на Scheffé, се използва за определяне на значимостта на разликите между три независими групи. Сравненията между две групи бяха извършени с помощта на Mann-Whitney U-тест за две независими групи и тест на Wilcoxon с ранг за повторни измервания. A P стойност на

функционални

Фиг. 1.Промени във физиологичните параметри през експерименталния период при мишки при всяка диета. Показани са парцели с телесно тегло (A), ниво на глюкоза в кръвта (Б.) и систолично кръвно налягане (° С) с течение на времето при мишки на диета с ниско съдържание на мазнини (LFD), диета с високо съдържание на мазнини (HFD) или диета с високо съдържание на мазнини (HFDR). Стойностите са средни стойности ± SE; н = 14–19, 14–19 и 10 при мишки, съответно на LFD, HFD или HFDR. Статистическите анализи бяха извършени чрез еднопосочен ANOVA, последван от теста на Scheffé. *P


Фиг. 2.Коремна компютърна томография (КТ) при седмица 12 от експерименталния период за мишка на LFD (A), HFD (Б.) и HFDR (° С).

маса 1. Характеристики на 12-та седмица от експерименталния период

Стойностите са средни стойности ± SE; н = 10–13 мишки на = диета с ниско съдържание на мазнини (LFD), н = 11–13 мишки на диета с високо съдържание на мазнини (HFD) и н = 7–10 мишки на диета с високо съдържание на мазнини (HFDR). Приемът на храна е средната стойност през целия експериментален период. 8-OH-dG, 8-хидрокси-2'-дезоксигуанозин. Статистическите анализи бяха извършени чрез еднопосочен ANOVA, последван от теста на Scheffè.

* P † P

Фиг. 3.Бъбречни промени през експерименталния период при мишки при всяка диета. A: 24-часова екскреция на албумин с урина. Б.: тегло на бъбреците при седмица 12 при мишки на LFD, HFD или HFDR. Стойностите са средни стойности ± SE; н = 11, 11, 9 при мишките на LFD, HFD или HFDR за екскреция на албумин в урината и н = 10, 10 и 9 при мишките на LFD, HFD или HFDR за тегло на бъбреците, съответно. Статистическите анализи бяха извършени чрез еднопосочен ANOVA, последван от теста на Scheffé. *P


Фиг. 4.Хистологични особености в бъбреците на мишки при всяка диета. Представителни светлинни микроскопични характеристики на оцветени с периодична киселина Шиф (PAS) бъбречни секции от мишки на LFD (A), HFD (Б.) или HFDR (° С) в седмица 12 от експерименталния период. Оригинално увеличение × 400. Също така е показан количествен анализ за областта на гломерулната туфа (д) и мезангиална матрична област (Е.) в мишките на LFD, HFD или HFDR. Стойностите са средни стойности ± SE; н = 10, 10 и 7 при мишките съответно на LFD, HFD или HFDR. Статистическите анализи бяха извършени чрез еднопосочен ANOVA, последван от теста на Scheffé. *P

Бъбречни патогенетични промени при мишки с HFD.

При мишките на HFD при седмица 12, електронно-микроскопско изследване показа увеличения извънклетъчен матрикс, неравномерно удебеляващата се гломерулна базална мембрана и ефацементите на процеса на стъпалото в част от гломерулите (фиг. 5). Имунофлуоресцентното проучване разкрива, че натрупването на колаген тип IV, един от основните извънклетъчни матрични протеини, е увеличено в гломерулите на мишките с HFD (Фиг. 6, A и Б.). В бъбречните секции от мишки във всяка група, изследвани чрез оцветяване с маслено червено О, натрупването на неутрален липид се открива в гломерулите и проксималните тубули на мишките на HFD, но не и на мишките на LFD (Фиг. 6, ° С и д). Също така, F4/80 (макрофагов маркер) -положителни клетки се наблюдават главно в бъбречната медула (Фиг. 6, Е. и F). Броят на F4/80-положителните клетки в бъбречната медула значително се е увеличил при мишки с HFD от тези на LFD (4.64 ± 0.52/HPF срещу 2.74 ± 0.45/HPF, P

Фиг. 5.Ултраструктурни характеристики в бъбреците на мишки с HFD. Представителни електронни микрографии са показани от мишки на LFD (A и ° С) или HFD (Б. и д) в седмица 12. Разширяването на мезангиалната матрица е обозначено със звездичка (Б.), неправилно удебеляване на гломерулната базална мембрана от черна стрелка (д), а кракът обработва ефацециите с бяла стрелка (д). Оригинално увеличение × 5000 (A и Б.) и × 20 000 (° С и д). Mes, мезангиална клетка; CP, капилярен лумен.


Фиг. 6.Патологични промени в бъбреците на мишки при HFD. Имунофлуоресцентно проучване за колаген тип IV върху бъбречни секции от мишки на LFD (A) или HFD (Б.) в седмица 12 е показан. Оригинално увеличение × 400. ° С и д: маслено червено O оцветяване на бъбречни секции на LFD (° С) или HFD (д ) в седмица 12. Оригинално увеличение × 400. Е. и F: имунохистохимия за F4/80 на бъбречни сечения на LFD (Е.) или HFD (F) в седмица 12. Оригинално увеличение × 100.


Фиг. 7.експресия на иРНК на ренин, ангиотензин конвертиращ ензим (АСЕ) и ангиотензиноген в бъбреците. Стойностите са средни стойности ± SE; н = 7-11 при мишките на LFD и н = 8–12 на HFD. Статистически анализи са извършени от Mann-Whitney U-тест. *P

Нарушено боравене с натрий при мишки с HFD.

За да изследваме един от механизмите на HFD-индуцирано повишаване на систоличното кръвно налягане, най-накрая изследвахме солевата чувствителност при мишките на HFD. Първо се изследва отделянето на натрий в урината в отговор на остро натоварване със сол. През първите 4 часа отделянето на натрий с урината (фиг. 8A) и обема на урината (фиг. 8Б.) са били значително по-ниски при мишките на HFD, отколкото тези при мишките на LFD. В края на 6 часа общата екскреция на натрий в урината и обемът на урината са малко, но не значително по-ниски и по-малки в тази група. След това се изследва ефектът от 4-седмично натоварване на сол върху систоличното кръвно налягане. При мишките с HFD повишаването на систолното кръвно налягане с 4-седмично натоварване със сол е по-голямо от това при мишките с HFD без натриево натоварване при седмица 12 от експерименталния период (13,6 ± 2,1 срещу 4,8 ± 2,5 mmHg, P

Фиг. 8.Екскреция на натрий в урината след остро натоварване със сол. Екскреция на натрий в урината (A) и обема на урината (Б.) при мишки на диета с ниско съдържание на мазнини (LFD) или диета с високо съдържание на мазнини (HFD) в продължение на 6 часа след интраперитонеално инжектиране на 0,9% физиологичен разтвор. Данните са изразени като кумулативна екскреция на натрий в урината. Стойностите са средни стойности ± SE; н = 8 при мишките на LFD и н = 9 на HFD. Статистически анализи са извършени от Mann-Whitney U-тест. *P


Фиг. 9.Крива налягане-натриуреза и индекс на чувствителност към сол. Крива на налягане-натриуреза на мишките на диета с ниско съдържание на мазнини (LFD) или на мишки на диета с високо съдържание на мазнини (HFD) и индекс на чувствителност към сол, -1,17 ± 3,4 при мишките на LFD срещу 34,03 ± 6,3 мишки на HFD (P

В това проучване потвърдихме, че храненето с HFD на мишки C57BL/6 предизвиква големи системни промени, съвместими с метаболитния синдром на човека, включително затлъстяване, хипергликемия, хиперинсулинемия, хипертриглицеридемия и хипертония. След появата на метаболитен синдром, мишките с HFD развиват увеличени ОАЕ и гломерулни лезии с натрупване на извънклетъчен матричен протеин. Освен това демонстрирахме бъбречни патофизиологични промени, включително натрупване на липиди, инфилтрация на макрофаги, повишен оксидативен стрес и нарушено боравене с натрий при мишки с HFD. Тези системни промени и увреждания на бъбреците бяха предотвратени чрез контрол на телесното тегло с диетично ограничаване на храненето с HFD, което предполага, че увеличаването на телесното тегло, а не храненето на HFD като такова, допринася за развитието на тези аномалии.

По-рано съобщавахме, че пациентите с метаболитен синдром развиват чувствителна към сол хипертония (45), което също е един от важните механизми на бъбречна дисфункция при метаболитен синдром (12, 45). В това проучване мишките на HFD показват забавяне на екскрецията на натрий в урината чрез остро натоварване със сол и чувствително към солта повишаване на систоличното кръвно налягане чрез 4-седмично натоварване на сол. Също така, нивата на експресия на иРНК на ренин, АСЕ и ангиотензиноген в бъбреците на мишките на HFD бяха увеличени в сравнение с тези на мишките на LFD, което предполага бъбречно активиране на RAS при мишките на HFD. Съобщава се, че активирането на бъбречната RAS е свързано с нарушено боравене с натрий в бъбреците (5, 35, 38, 41, 47). По този начин анормалната чувствителност към сол, която може да бъде свързана с активирането на бъбречната RAS, е един от механизмите на бъбречни увреждания и хипертония при мишките на HFD.

Съобщава се, че човешкият метаболитен синдром е свързан с ХБН, дефиниран като албуминурия и намалена скорост на гломерулна филтрация (7, 32). Също така е известно, че развитието на гломеруломегалия и фокална сегментна гломерулосклероза е свързано с масивно затлъстяване (17, 20, 21). Повечето от съответните хистологични изследвания обаче са ограничени до малки аутопсии или оперативни случаи, тъй като е технически трудно да се извърши бъбречна биопсия при пациенти със затлъстяване. Следователно остава неясно дали има специфични патологични характеристики на свързаното с метаболитен синдром бъбречно заболяване. В това проучване наблюдавахме, че мишките C57BL/6 на HFD развиват бъбречни функционални и патологични аномалии, подобни на наблюдаваните при пациенти със затлъстяване или метаболитен синдром. Доказателствата сочат, че този модел може да бъде полезен за изясняване на патологичните характеристики на ХБН, свързани с метаболитен синдром.

В обобщение, ние характеризирахме структурните и функционални промени в бъбреците на мишки C57BL/6 върху HFD като миши модел на метаболитен синдром. Предлагаме, че допълнителни изследвания, използващи този модел на мишка, биха били полезни за изясняване на бъбречната патогенеза, свързана с метаболитен синдром и разработване на нови терапевтични стратегии за ХБН, свързани с метаболитен синдром.

Тази работа е финансирана от безвъзмездни средства от Фондацията за научни изследвания на солта (№ 0724) и Научната фондация Такеда.

СТЪПКИ

Разходите за публикуване на тази статия бяха покрити отчасти чрез плащането на такси за страница. Следователно статията трябва да бъде маркирана с „реклама”В съответствие с 18 U.S.C. Раздел 1734 единствено, за да посочи този факт.

Благодарни сме на проф. Hiroyuki Matsuno от Катедрата по клинична патологична биохимия, Doshisha дамски колеж по свободни изкуства, за споделянето на неговата техника в компютърна томография на мишки. Благодарим на Макико Сера, д-р Юки Танака и Централната изследователска лаборатория на Медицинския университет в Шига за отлична техническа помощ.