Адам Б. Хол

1 Катедра по химия и химическа биология и Институт Барнет, Североизточен университет, Бостън, Масачузетс 02115

2 Програма за биомедицински съдебни науки, Медицински факултет на Университета в Бостън, Бостън, Масачузетс 02118

Стивън Л. Кой

1 Катедра по химия и химическа биология и Институт Барнет, Североизточен университет, Бостън, Масачузетс 02115

Амол Кафле

1 Катедра по химия и химическа биология и Институт Барнет, Североизточен университет, Бостън, Масачузетс 02115

Джеймс Глик

1 Катедра по химия и химическа биология и Институт Барнет, Североизточен университет, Бостън, Масачузетс 02115

Еркинжон Назаров

3 Draper Lab. Център за биоинженеринг в USF, бул. Спектър 3802, Suite 201, Тампа, FL 33612-9220

Пол Вурос

1 Катедра по химия и химическа биология и Институт Барнет, Североизточен университет, Бостън, Масачузетс 02115

Свързани данни

Резюме

ВЪВЕДЕНИЕ

Взаимовръзката между различните видове разделяне, базирани на йонна мобилност, с йонизационна масова спектрометрия с атмосферно налягане (API-MS) създаде мощен нов клас хибридни инструменти, базирани на методи за йонна подвижност, допълващи масовата спектрометрия. Макар да не се разглеждат като заместител на хроматографските методи с висока разделителна способност, методите за йонна мобилност имат уникални характеристики, включително способността да отделят йони, неразрешими от MS, като изобарни съединения, структурни изомери и при специални условия стереоизомери или хирални изомери. Освен това някои техники като DMS/FAIMS работят в милисекунди (ms), така че сложните планирани MS операции не се засягат. Предварителното филтриране на йонни видове на предната страна на масспектрометрите може значително да намали химичния шум в записаните масспектри [1, 2, 3] и да подобри чувствителността на откриването на МС.

Понастоящем съществуват поне четири типа методи за разделяне, базирани на йонна мобилност, които функционират при условия на околната среда. Това са времето на дрейф на полетна спектрометрия на йонната подвижност (DT-IMS) [4,5], спектрометрия на подвижната йонна подвижност (TWIMS) [6], спектрометрия на диференциална йонна подвижност (DMS/FAIMS) [7] и аспирационна йонна подвижна спектрометрия ) [8]. IMS и TWIMS работят в импулсни режими с разделяне на йони въз основа на времето за полет в дрейфова тръба или структура на пътуваща вълна. DMS и AIMS спектрометрите могат да бъдат класифицирани като спектрометри от пространствен тип, тъй като тези системи дискриминират въз основа на йонни траектории и работят непрекъснато. И двата метода DMS и AIMS предлагат предимства, когато се използват като йонен предфилтър за масова спектрометрия, тъй като и двата работят непрекъснато.

Конвенционален IMS, при който йони преминават през дрейфова тръба под въздействието на слабо електрическо поле с постоянен ток, първо е свързан с магнитен масспектрометър [4, 5], а след това и с допълнителни MS системи [9, 10] като време на полет MS [11, 12], единични [13] и тройни квадруполи [14] MS, йонен капан [15] и FT-ICR масспектрометри [16]. Конвенционалният IMS има известно сходство с TOF-MS, тъй като и двата са импулсни методи, въпреки че IMS работи в милисекунден времеви режим, докато последният обикновено повтаря сканиране с по-висока kHz скорост. В обратен режим на свързване, квадруполен йонен капан също е бил използван за натрупване на йони от първи етап преди конвенционалния IMS анализ [17, 18]. Предварителната концентрация на йони в йоноуловителя осигурява увеличен динамичен обхват и по-висока IMS селективност в приложения, включващи характеризиране на нековалентни комплекси и разделяне на конформационни изомери на ароматни йони.

Основна слабост на конвенционалния IMS-MS е неговият нисък работен цикъл (време на впръскване/време на дрейф) и загуби на йони между циклите, въпреки че това ограничение може да бъде разрешено чрез мултиплекс техники [19]. Без мултиплексирана работа повечето йони от йонния източник се губят между инжекциите, неутрализирани по стените на йонизационната камера или затворните решетки [20]. В допълнение, високата разделителна способност на IMS изисква по-дълги времена на отклонение, което допълнително намалява работния цикъл. Ние вярваме, че техниките за йонна мобилност, работещи в непрекъснат режим, са изгодни и че високата селективност за по-малки органични вещества и бързото разделяне на DMS/FAIMS могат да осигурят значителни предимства за масова спектрометрия.

Спектрометрията за диференциална йонна подвижност (DMS/FAIMS) се появи в началото на 90-те години като метод за разделяне и откриване на йони [21]. В спектрометрията на диференциалната подвижност, за разлика от конвенционалната йонна подвижност, йони се разделят при налягания, при които движението на йони се контролира от йонно-неутрални сблъсъци. Поради сложната химическа природа на йонно-неутралните взаимодействия, йонно-неутралната сблъсъчна площ на напречното сечение варира в зависимост от амплитудата на полето при интензивни трептящи електрически полета [22, 23]. Йонната мобилност се модифицира чрез реакции на клъстериране/де-клъстериране по време на части с високо и ниско електрическо поле на DMS полетата, като йоните са по-групирани при ниско поле, отколкото високо, като по този начин се увеличава естественият ефект на диференциална мобилност [24, 25].

През последните петнадесет години технологията за диференциална йонна мобилност е докладвана в множество конструкции и приложения на приборите [26, 27, 28, 29, 30, 31, 32] и е свързана с различни мас спектрометри [33, 34]. Един дизайн, наричан полева асиметрична йонна подвижна спектрометрия (FAIMS), използва цилиндрични коаксиални тръби и се предлага в търговската мрежа чрез Thermo Scientific [35], докато SelexION ™ Technology използва плоска конфигурация и се продава от AB SCIEX. Използваният тук плосък дизайн има някои уникални функции, включително бързо превключване между режим на филтриране с пълна селективност и прозрачен режим, при който всички йони се предават в MS. Превключването на режима осигурява удобен начин за сравняване на спектрите със и без разделяне на йони, функция, използвана в тези изследвания. Плоските и цилиндричните конструкции са сравнени от Shvartsburg et al. [36], където беше установено, че равнинните конструкции осигуряват по-висока селективност. В допълнение, равнинните конструкции позволяват използването на модификатори на транспортен газ - малки органични молекули, наричани още добавки - които подобряват разделянето на диференциалната мобилност чрез използване на обратимо групиране, за да се увеличи разликата между висока и ниска мобилност на полето [24, 25, 37, 38, 39].

В усилията си да разширим динамичния обхват на йоноуловителя, ние сме свързали плосък, диференциален спектрометър за диференциална йонна подвижност към класически йонния капан LCQ, за да проведем йонна филтрация преди масовия анализ. Провеждането на разделяне, основано на диференциална мобилност, преди анализ на масата позволява на анализатор да филтрира популация от йони, създадени от смес, чрез електроспрей или други методи и избирателно да въведе целеви видове в капана за анализ на масата. За да се оцени дали филтрирането с диференциална мобилност може да увеличи броя на прицелните йони, заредени в капана, да потисне матричните йони и да подобри динамичния обхват, бяха проведени експерименти чрез промяна на времето за пълнене на капана с проби с известна концентрация. Проведени са директни сравнения между употребите на DMS филтрация (избран в сравнение с прозрачен режим) с особен акцент върху неговата приложимост към анализа на бензоилекгонин (BE), метаболит на кокаин от биологична матрица.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛНА СЕКЦИЯ

Експериментални условия

Планарната DMS система, използвана по време на това изследване, е разработена от Sionex Corporation (сега не съществува) и има филтърна междина с височина 0,5 mm × 3,0 mm широчина × 10,0 mm дължина. Тези размери балансират изискванията за разделителна способност, както и загубите от дифузия за измерения входящ поток от приблизително 0,6 литра/мин. Електрониката е произведена от Sionex и осигурява полетата за разделяне и компенсация от типа на обратния полет, както е описано в Krylov et al. [40].

разширяване

Схема на входящата система DMS - MS. (а) източник на йони, (б) газ за разтваряне и въвеждане на модификатор, (в) подбор на йони на DMS, (г) първи етап на вакуум на мас спектрометъра.

Thermo-Finnigan, LCQ Classic служи като масспектрометър за йонен капан за откриване на DMS-разделени видове. Разрешените от DMS видове влязоха в капана чрез импулсен електростатичен контрол на йонната порта. Периодът, през който на йоните е било позволено да влязат в уловителя, известен също като период на йонизация, се оценява чрез изключване на функцията за автоматично регулиране на усилването (AGC) и ръчно регулиране на времето за пълнене на йоноуловителя. AGC за настройките, използвани за експериментите с този инструмент, бяха: пълна цел на MS: 5 × 10 7 и SIM цел: 2 × 10 7 броя съответно с максималното време за инжектиране, зададено на 200 ms. След приключване на периода на йонизация се извършва фрагментация на предшествениците чрез сблъсъчно активиране.

Материали и методи

Основната концентрация на стандарта за бензоилекогонин (BE) е 1 mg/ml в MeOH (Cerilliant, Round Rock, TX). Използваният вътрешен стандарт беше деутериран аналог на бензоилекогонин (BE-d3) в концентрация от 100 ug/ml в MeOH (Cerilliant, Round Rock, TX). Стандартът за синтетична урина също е получен от Cerilliant и е служил като отрицателна контрола за приготвянето на добавените проби.

Осем проби от бензоилекогонин с крайна концентрация от: 25 ng/µl, 10 ng/µl, 7,5 ng/µl, 5 ng/µl, 2,5 ng/µl, 1 ng/µl, 0,5 ng/µl и 0,1 ng/µl бяха приготвени в 1,0 ml на синтетична урина (Cerilliant, Round Rock, TX). Избраният диапазон на концентрация представлява биологични стойности при или под тези, определени от Cone et al. (2003) на Националния институт за злоупотреба с наркотици [41] за количествено определяне на BE от биологични проби, използвайки традиционни GC или LC-базирани методологии. Вътрешният стандарт (BE-d3) се добавя във всяка от пробите от урина при концентрация от 0,5 ng/ul преди екстракция в твърда фаза. SPE се извършва с помощта на 130mg Clean Screen Xcel I колони (UCT, Bristol, PA). Колоните бяха предварително подготвени с 2 ml МеОН. Всяка проба се смесва с 1 ml фосфатен буфер (рН 6,0) и се зарежда върху колоните. Колоните се промиват с 1mL 98% CH3OH/2% CH3COOH (v/v) и се елуират с 1mL CH2Cl2/IPA/NH4OH (78/20/2 v/v/v). Елуентите се изсушават под вакуум в продължение на 1 час, след което се затварят и се съхраняват една нощ при 4 ° С. Преди DMS-MS анализ; пробите бяха възстановени в 200 µl подвижна фаза (70% MeOH/30% H2O/0,1% CH2O2 v/v/v).

РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ

Капацитетът на йонния капан като функция от времето на запълване

Като първоначално доказателство за концепцията, селективността на DMS филтъра беше тествана чрез сравняване на пълните сканиращи масови спектри (MS 1) на матрична заготовка в DMS-прозрачен и DMS-включен режим (Фигура 2). За последните условия компенсационното напрежение на DMS беше зададено на стойност CV = -16V, съответстваща на предаването на m/z 290, [M + H] + йон на BE в присъствието на модификатор на етилацетат. Както е показано на фигурата, DMS филтрирането е довело до пълно елиминиране на фона на матрицата и най-важното е премахване на m/z 289 потенциална интерференция към протонирания йон на BE при m/z 290. Трябва да се отбележи, че тази селективност беше демонстрирано дали AGC е включен или изключен (данните не са показани). При по-нататъшен тест за тази селективност беше изследвана пробата с най-ниска концентрация на BE от 0,1 ng/µL. Както е показано на Фигура 2 (в), работата на системата в режим DMS-on дава добре дефиниран сигнал на аналита заедно с такъв за деутерирания вътрешен стандарт с очакваното съотношение 10: 1 IS/аналит.

Анализ на BE в урината чрез DMS-MS. (а) Пълно сканиране на мас спектъра (m/z 150 - m/z 500) на разтвор на празна проба в режим DMS-прозрачен; (b) Пълен сканиран масов спектър (m/z 150 - m/z 500) на предходно решение с DMS-on при CV = -16V, показващ отстраняване на всички матрични йони, включително потенциални смущения при m/z 289; (c) Анализ на BE в урината (0,1ng/µL) с DMS, зададен на CV = -16V, показващ съотношението 1:10 аналит: вътрешен стандарт. Обхват на MS сканиране (m/z 182 - m/z 296).

Интензитет на родителски йонни сигнали за BE [M + H] + = 290, начертан като функция от промяна на времето за запълване на йоноуловителя. Вмъкване: линейна зависимост на натрупването на йони от времето на запълване. Лентите за грешки представляват стандартното отклонение на трикратните измервания.