Катедра по физиология, Медицински университет в Белосток

време

Mickiewicza 2C, 15-222, Бялосток (Полша)

Тел. +48857485624, факс +48857485585, имейл [email protected]

Сродни статии за „“

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • електронна поща

Резюме

Въведение

Материали и методи

Животни и дизайн на изследване

Измервания на плазмата

Концентрациите на плазмена глюкоза, инсулин и свободни мастни киселини бяха определени с помощта на глюкометър Accu-Chek (Bayer, Базел, Швейцария), комплект ELISA за плъхов инсулин (Mercodia, Упсала, Швеция) и газово-течна хроматография (GLC), съответно. Концентрациите на глюкоза на гладно и инсулин бяха използвани за изчисляване на индекса на инсулинова резистентност (HOMA-IR = глюкоза на гладно (mmol/l) x инсулин на гладно (µU/ml)/22,5).

Клетъчно фракциониране на сърдечните миоцити

Изолиране на митохондрии

Митохондриите бяха изолирани от лявата камера чрез използване на метод за смилане на трипсин [20,21]. Накратко, лявата камера се смила на малки парченца и се суспендира в 10 ml изолиращ буфер (0,3 М захароза, 10 тМ натриев HEPES, рН 7,2, 0,2 тМ EDTA). След това към изолационния буфер с миокардна тъкан се добавя трипсин и пробите се инкубират в продължение на 15 минути. След смилане на трипсин пробите се разреждат с 10 ml изолиращ буфер, съдържащ говежди серумен албумин (BSA) и трипсинов инхибитор. Суспензията се смесва и супернатантата се изхвърля. След това, усвоената миокардна тъкан се ресуспендира в 10 ml изолиращ буфер с BSA и се хомогенизира в стъклен хомогенизатор. Полученият хомогенат се центрофугира за 10 минути при 600 g, след което супернатантата се центрофугира отново (15 минути, 8 000 g). Получената пелета се ресуспендира в 10 ml изолиращ буфер с BSA и се центрофугира (15 минути, 8000 g). Тази стъпка се повтори два пъти. Крайната пелета се ресуспендира в 500 ul изолационен буфер с BSA. При всяка стъпка от процедурата се поддържа ниска температура (4 ° С).

Имуноблотинг

Интрамиокардни липидни анализи

Пробите от лявата камера бяха прахообразни и липидите бяха екстрахирани в разтвор на хлороформ-метанол съгласно метода на Folch [23]. Липидните фракции на фосфолипидите (PL), FFA, диацилглицеролите (DAG) и TAG бяха разделени с помощта на тънкослойна хроматография (TLC) [24]. Отделни метилови естери на мастни киселини бяха идентифицирани и количествено определени в зависимост от времето на задържане на стандартите чрез GLC (газов хроматограф на Hewlett-Packard 5890 Series II, капилярна колона HP-INNOWax). Общото съдържание на PL, FFA, DAG и TAG се изчислява като сбор от конкретните видове мастни киселини на оценяваните фракции и се изразява в наномоли на грам тъкан.

Съдържанието на керамид (CER) беше определено чрез използване на високоефективна система за течна хроматография (HPLC), както беше описано по-рано [25]. Накратко, пробите от лявата камера се хомогенизират и липидите се екстрахират в хлороформ. Аликвотна част от липидния екстракт се прехвърля в прясна епруветка с предварително добавени 40 pmol N-палмитоил-D-еритро-сфингозин (основа С17) (вид подарък от д-р Z. Szulc, Медицински университет в Южна Каролина) като вътрешен стандарт. След това пробите бяха подложени на алкална хидролиза до деацилат церамид. След това освободеният от церамид сфингозин се превръща в техните производни на о-фталалдехид и се анализира, използвайки HPLC система, оборудвана с флуоресцентен детектор и колона с обърната фаза C18 (Varian Inc. OmniSpher 5, 4.6 × 150 mm). Екстрактът от хлороформ, използван за измерване на керамид, също съдържа малки количества свободни сфингоидни основи. Следователно, съдържанието на керамид беше коригирано за нивото на свободен сфингозин, определено в същата проба. Преди анализа на сфинголипидите, съдържанието на протеин се измерва във всички проби със BSA като стандарт и съдържанието на керамиди се изразява в наномоли на mg от протеина.

Съдържание на дълговерижен мастен ацил-CoA (LCFA-CoA)

Общото съдържание на LCFA-CoA е оценено, както е описано по-подробно по-рано [25]. Накратко, количеството LCFA-CoA е измерено индиректно след хидролиза до свободно CoA съгласно метода на Ingebretsen et al. [26]. Пробите от лявата камера се хомогенизират в ледено студена 6% перхлорна киселина и се центрофугират (10 минути, 1600 g). След това получената пелета, съдържаща LCFA-CoA, се промива два пъти съответно с 0.6% перхлорна киселина и вода. Пелетата се ресуспендира чрез ултразвукова обработка във вода и 1,77 М КОН и се инкубира (60 минути, 55 ° С). След инкубация пробите се охлаждат и се прибавя 0,5 М триетаноламин-НС1 в 6% перхлорна киселина. След това пробите бяха центрофугирани (10 минути, 5200 g), 100 µl от супернатантата бяха инжектирани в колоната (Varian Inc. OmniSpher 5, 4.6 × 150 mm) и съдържанието на освободен CoA беше оценено с HPLC система, оборудвана с UV детектор, използващ градиентно елуиране. Съдържанието на LCFA-CoA във всички проби се изразява в наномоли на маса мокра тъкан.

статистически анализи

Всички данни са изразени като средни стойности ± SEM. Статистическата разлика между групите беше тествана с дисперсионни анализи и подходящи post hoc тестове, или със студентски t-тест, използващ Statistica версия 10 (StatSoft, Краков, Полша). Резултатите се считат за статистически значими на P-та седмица: + 483,1%; 5-та седмица: + 581,3%, P 0,05, фиг. 2C). От друга страна, плазмалемалната и интрамиоцелуларната експресия на FABPpm остава стабилна през всяка седмица от режима на HFD (P> 0,05, фиг. 2В и 2D).

Фиг. 2

Експресия на FAT/CD36 (A и C) и FABPpm (B и D) в плазмени мембрани (PM) и микрозоми с ниска плътност (LDM) в миокарда, съответно след хранене с високо съдържание на мазнини. Данните са изразени като средна стойност ± SEM и се основават на шест независими определяния (n = 6). Светлосивите точки се наричат ​​PM и черните точки като LDM в HFD групи (седмица 1, 2, 3, 4 и 5). Белите точки са посочени като контролна група. * Пета седмица: + 22,2%; четвъртата седмица: + 49,4%; 5-та седмица: + 22,0%, P-та седмица: + 47,1%; втората седмица: + 65,4%; третата седмица: + 28,6%; 4-та седмица: + 46,7% и 5-та седмица: + 32%, P 0,05, фиг. 3C).

Фиг. 3

Освен това е добре известно, че инсулинът чрез активиране на PI3 киназния път е способен да индуцира транслокация на FAT/CD36 (не FABPpm) към сарколемата, като по този начин увеличава притока на мастни киселини в кардиомиоцитите [19,41]. Много вероятно е в нашето проучване и подобни модели на инсулинова резистентност [27] повишената експресия на FAT/CD36 при сарколемата на кардиомиоцитите (4-та и 5-та седмица на HFD) да е резултат от увеличена транслокация на FAT/CD36 към плазмена мембрана поради значително високи концентрации на плазмен инсулин едновременно. Освен това, неотдавнашните доклади показват, че повишената базална активност на Akt по време на HFD хранене [11], както и активирането на PPARs [17] може да са отговорни за трайното преместване на FAT/CD36 от вътреклетъчните отделения към плазмената мембрана в сърцето. Изненадващо, плазмолемалната експресия на FABPpm в лявата камера за разлика от FAT/CD36 не се променя през пет седмици хранене на плъхове с HFD, което е в съответствие с някои други доклади, свързани със състоянието на инсулинова резистентност (ZDF плъхове) [42]. Вероятно липсата на редувания в експресията на FABPpm е резултат от непроменена концентрация на свободни мастни киселини в плазмата и нечувствителност на този транспортер към инсулинова стимулация [19].

В заключение, това проучване за първи път демонстрира, че HFD през всяка седмица от неговата продължителност причинява промени в липидния профил в сърдечния мускул. Диетичните мастни киселини значително повлияват липидния метаболизъм на миокарда (от 3-та до 5-та седмица) най-вече чрез повишаване на съдържанието на TAG, LCFA-CoA, CER и FFA фракция. Вероятно е в края на третата седмица на HFD количеството на вътремиоцелуларния LCFA-CoA да надвиши β-окислителната способност на сърдечните миокти и да започне прогресивно натрупване на липиди в миокарда. Вероятно тези редувания при използването на липиди могат да нарушат метаболизма на глюкозата и в крайна сметка да доведат до липотоксичност и кардиомиопатия. Дали промените в сърдечния липиден профил са вредни за функционирането на сърцето изисква допълнително проучване.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от Медицинския университет в Белосток (номер на гранта 114-18920L, 124-18526L и 144-18510L) и Националния научен център в Полша (номер на гранта N N401 005236). Авторите нямат конфликт на интереси за деклариране.

Декларация за оповестяване

Авторите нямат конфликт на интереси за деклариране.