1 Колеж по бионауки и биотехнологии, Аграрен университет Хунан, Чангша, Хунан 410128, Китай

доза

2 Hunan Institute of Animal and Veterinary Science, Changsha, Changsha 410131, China

Резюме

Целта на това проучване е да изследва връзката между хранителните добавки с ниски дози с хитозан (COS) и телесното тегло, приема на фураж, чревната бариерна функция и пропускливостта при мишки. Двадесет мишки бяха разпределени на случаен принцип да получат неподправена контролна диета (контролна група) или хранителна добавка с доза от 30 mg/kg хитозан (COS група) в продължение на две седмици. Въпреки че не са открити значителни разлики между условията за телесно тегло или прием на храна и вода, мишките от групата на COS са имали повишено съдържание на серумен D-лактат (

) и намалена активност на йеюналната диаминоксидаза (DAO) (). Освен това, мишките в COS група показват намалена експресия на оклудин и ZO-1 () и намалена експресия на оклудин в илеума (). Изводът, направен от тези констатации, показва, че въпреки че диетата с добавка на COS с 30 mg/kg няма ефект върху телесното тегло или приема на фураж при мишки, тази доза може да компрометира чревната бариерна функция и пропускливостта. Това изследване ще допринесе за насоките относно COS добавките.

1. Въведение

Хитозанът (COS) е алкален глюкозаминов полимер, получен от хидролизиран хитозан [1]. Подобно на други растителни полизахариди, молекулите на хитозана имат редица биологични дейности, като антибактериално свойство, имунен ефект и профилактика на болести [2].

Обикновено пептидите и протеините не се абсорбират добре през чревния тракт; Доказано е, че хитозанът значително подпомага чревната абсорбция на макромолекулите. Смята се, че механизмите зад усилената абсорбция са свързани с мукоадхезия и релаксиращи междуклетъчни стегнати връзки [3]. Мукоадхезията описва адхезията между два материала, където единият е лигавична повърхност. Мукусната мембрана носи отрицателно заредени групи на сиалова киселина и взаимодейства с положително заредените аминогрупи на хитозана [4].

Хитозанът е привлекателна добавка за храна за животни [5] поради присъщите му антимикробни свойства [5], но се използва ограничително поради високия вискозитет и разтворимост [6]. Изследванията на ефекта на хитозана върху растежа на прасенца приписват влиянието върху имунната способност, морфологията на червата и функцията на микрофлората [7, 8]. Резултатите са променливи, а дозите, използвани в проучванията, са големи (100 mg/kg – 5 g/kg). По-ранното ни проучване използва ниски дози хитозан (30 mg/kg) за допълване на диетичните прасенца, което води до окислителни и имунни реакции на тънките черва и намаляване на ефективността на чревната бариера [9]. За това проучване прогнозирахме, че добавка с ниски дози хитозан ще наруши чревната пропускливост и функция чрез определяне на експресията на гените на бариерната функция и протеините при мишки.

2. Материали и методи

2.1. Експериментален дизайн

Това проучване е проведено в съответствие с насоките на Лабораторната комисия по етични животни към Китайската академия на науките. Шестседмични ICR мишки са закупени от SLAC Laboratory Animal Central (Changsha, Hunan, China). Мишките бяха държани в чисти животински колонии (температура, 25 ° C, относителна влажност, 53%; 12 часа тъмно/12 часа светлина); мишките са имали ad lib достъп до вода и типична диета за гризачи [10]. След три дни мишките бяха разпределени на случаен принцип в COS група (

) или контролна група (). В продължение на две седмици мишките от контролната група получават базална диета [10], докато диетата в експерименталната група е допълнена с 30 mg/kg хитозан. Хитозанът е получен от Далианския химически и физически институт (Китайска академия на науките, Далиан, Китай); молекулите са съставени от 5 олигомери със средно молекулно тегло от 1000 до 2000 Da, минимално съдържание на захар от 85% и 99% разтворим във вода. След две седмици мишките бяха умъртвени и йеюнумът беше възстановен. Пробите бяха замразени и държани при –80 ° C, докато се наложи.

2.2. Анализ на чревната пропускливост

Серумните нива на D-лактат бяха оценени с помощта на търговски комплект от китайско-германския Beijing Leadman Biotech Ltd., Пекин, Китай и химичен анализатор Beckman CX4 (Beckman Coulter, CA, USA). Експериментът за активност на серумна диаминооксидаза е установен чрез комплекти за анализ, които са използвани съгласно инструкциите на производителя (Институт по биоинженерство в Нанкин Джианчен, Нанкин, Дзянсу, Китай).

2.3. RT-PCR на гени с тясна връзка

Пълната РНК се възстановява от смлян йеюнум, като се използва реагент TRIzol (Invitrogen, САЩ) и се третира с DNase I (Invitrogen, САЩ) съгласно инструкциите, предоставени от производителя. синтезът на cDNA беше осъществен, като се използва олиго (dT) 20 и Superscript II обратна транскриптаза (Invitrogen, САЩ). Грундовете са избрани въз основа на предишни изследвания [10]. β-актинът е избран като референтен ген.

2.4. Имуноблотинг на плътно съединени протеини

Следвайки инструкциите, предоставени с комплекта за екстракция на общ протеин (KGP200, Keygen Biotech, Nanjing, Jiangsu, China), общият протеин беше изолиран. Равни количества чревни лигавични протеини бяха изолирани с помощта на полиакриламиден гел, преди да бъдат преместени върху мембрана от поливинилиден дифлуорид (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, USA). След това те се инкубират с първични антитела (козе поликлонално клаудин-1 антитяло, заешко поликлонално ZO-1 антитяло и β-актиново заешко антитяло) (Santa Cruz Biotechnology, Калифорния, САЩ) за 12 часа при 4 ° C. Впоследствие PVDF мембраните бяха инкубирани с вторичните антитела (кози анти-заешки IgG-HRP и заешки анти-кози IgG-HRP) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) за 120 минути при 25 ° C. Уестърн петна се визуализират с помощта на подобрен комплект за откриване на хемилуминесценция (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) и се снимат със софтуера Alpha Imager 2200 (Alpha Innotech Corporation, CA, USA). β-референтните протеини на актини са разпределени по равно между групите. Стойността на протеиновата експресия се определя като съотношението на денситометрията на протеините с плътно свързване и β-актин.

2.5. Статистически анализи

Статистическите анализи на данни бяха проведени с помощта на SPSS 22.0 (Чикаго, IL, САЩ). Студентски

-беше използван тест за определяне на разликите между групите и значимостта беше определена при. Данните бяха представени като средно ± стандартната грешка на средното (SEM).

3. Резултати

3.1. Хитозанът с ниска доза няма ефект върху телесното тегло и приема на храна

Определен е ефектът от диета, допълнена с COS, върху телесното тегло на мишките, храната и приема на вода. След две седмици не е установена разлика в приема на храна и вода (Фигура 1) и телесно тегло (Фигура 2) между групите.



3.2. Ниската доза хитозан увеличава чревната пропускливост

За да се оцени целостта на червата, бяха измерени биомаркерите на нивото на D-млечна киселина в серума и на йеюналната диаминоксидаза. Фигура 3 показва, че серумният D-лактат в групата на COS е по-голям, отколкото в контролната група (), а активността на йеюналната диаминооксидаза в групата на COS е по-ниска от тази в контролната група ().

3.3. Хитозанът с ниска доза намалява експресията на гени и протеини с плътно свързване

ZO-1, клаудин-1 и оклудин са протеини с плътно свързване на червата, които са от съществено значение за поддържане на стабилността на плътните връзки и бариерната функция. В това проучване бяха оценени нивата на йеюналната лигавица на ZO-1, клаудин-1 и оклудин иРНК. Експресионните нива на mRNA за всички чревни сегменти са показани на Фигура 4. В сравнение с контролната група, експресията на йеюнал на ZO-1 и оклудин в COS група е значително по-ниска в експерименталната група (). Същата тенденция се наблюдава при Western blots чрез оценка на съответните нива на протеин (Фигура 5). В сравнение с мишките, хранени с контролна диета, нивата на протеин в йеюнума на ZO-1 и оклудин са значително намалени в групата на COS ().



4. Дискусия

Хитозанът е вторият най-разпространен полимер в природата [11] (целулозата е първият), който също е един от малкото положително заредени алкални полизахариди. Хитозанът като хранителна добавка е изследван за неговия потенциал като антимикробен стимулатор на растежа и е доказано, че насърчава растежа на пилета-бройлери [12, 13] и свине [14]. Това може да се дължи на по-висок прием на храна, серумен хормон на растежа и концентрации на IGF-1 [15]. В това проучване установихме, че диетата с ниска доза COS-добавка не оказва влияние върху приема на храна и вода или телесното тегло при мишки. Това повтаря констатацията от по-ранното ни проучване, че не е установен ефект върху средната храна и телесното тегло чрез използването на същата доза от 30 mg/kg хитозан за допълване на диетата на прасенца [9]. Huang et al. също така съобщава, че не е открита разлика в ефективността на растежа в проучване с пилета с бройлери, което използва висока доза хитозан (150 mg/kg) [12]. Разликите между дозировката, молекулното тегло, чистотата или разтворимостта на хитозана, използвани в този експеримент, и други могат да обяснят обратните резултати [16].

За да определим ефекта на хитозана върху интестиналната цялост, ние оценихме концентрацията на серумен D-лактат и йеюнална диаминооксидаза в съответствие с тези биомаркери, които са определени като полезни за определяне на интегритета на червата [17]. Намалената активност на чревната диамин оксидаза и повишените серумни нива на D-лактат съответстват на увреждане на клетките и тъканите [18]. Използвахме същите биомаркери за оценка на пропускливостта на червата. Нашите резултати показват повишаване на серумните нива на D-лактат и активността на диамин оксидазата в отговор на доза от 30 mg/kg хитозан; това предполага, че чревната цялост е нарушена.

Епителът на червата образува селективно пропусклива бариера, която е ключова за предотвратяване на патогенна инвазия. Плътните кръстовища са от основно значение за функционалността на бариерата и са отговорни за нейната цялост [19]. Протеините с плътно свързване обхващат редица интегрални мембранни протеини, които са свързани с протеини от цитоплазматична плака.

Оклудин, клаудин-1 и ZO-1 са протеини с плътно свързване, които се различават по своята молекулна структура и функция; те са колективно важни за поддържане на структурата и функцията на плътното кръстовище. Оклудин и клаудин-1 са трансмембранни протеини, които регулират функцията и целостта на плътната връзка [20]. Това е демонстрирано от Shen et al. че цитоскелетът регулира пропускливостта на пътя на изтичане чрез механизъм, който включва оклудин и ZO-1 [19]. От друга страна, Rosenthal et al. демонстрира, че парацелуларната пропускливост може да бъде модифицирана от хитозан, независимо от промените в протеините с плътно свързване [21]. В това проучване открихме промени в експресията на иРНК на ZO-1 и оклудин в групата на мишките, които са били хранени с добавка на COS. В групата на COS експресията на йерунална мРНК на оклудин е по-ниска и експресията на ZO-1 е намалена. Това наблюдение е в съответствие с повишената концентрация на серумен D-лактат и намаленото ниво на йеюналната диамин оксидаза. Експресията на мРНК на клаудин-1 обаче не е засегната. Тези открития показват, че при мишките целостта на чревната бариера е нарушена от ниски дози хранителни добавки с хитозан.

В заключение, в модела на мишка, доза от 30 mg/kg хитозанови добавки не повлиява ефективността на растежа, но нарушава целостта на чревната бариера. Констатациите от това изследване ще допринесат за насоките относно добавките с ниски дози хитозан.

Конкуриращи се интереси

Авторите декларират, че няма конкуриращи се интереси по отношение на публикуването на тази статия.

Благодарности

Този проект е финансиран от Националната фондация за естествени науки на Китай (31402092), Отворената фондация на ключова лаборатория за агро-екологични процеси в субтропичния регион, Институт за субтропично земеделие, Китайска академия на науките (ISA2015303), провинция Хунан, наука и технологии Департамент (2013FJ3011, 2014NK3048, 2014NK4134 и 2014WK2032) и Програма за отворени проекти на Държавна ключова лаборатория по хранителни науки и технологии, Университет Нанчанг (SKLF-KF-201416).

Препратки