Песен Цин

Отделение за интензивно лечение, свързана болница на Медицински колеж Zunyi, Zunyi, Гуйджоу 563000, P.R. Китай

mir-21-5p

Мяо Чен

Отделение за интензивно лечение, свързана болница на Медицински колеж Zunyi, Zunyi, Гуйджоу 563000, P.R. Китай

Хуей Джи

Отделение за интензивно лечение, свързана болница на Медицински колеж Zunyi, Zunyi, Гуйджоу 563000, P.R. Китай

Го-Юе Лю

Отделение за интензивно лечение, свързана болница на Медицински колеж Zunyi, Zunyi, Гуйджоу 563000, P.R. Китай

Хонг Мей

Отделение за интензивно лечение, свързана болница на Медицински колеж Zunyi, Zunyi, Гуйджоу 563000, P.R. Китай

Канг Ли

Отделение за интензивно лечение, свързана болница на Медицински колеж Zunyi, Zunyi, Гуйджоу 563000, P.R. Китай

Тао Чен

Отделение за интензивно лечение, свързана болница на Медицински колеж Zunyi, Zunyi, Гуйджоу 563000, P.R. Китай

Свързани данни

Анализираните набори от данни, генерирани по време на проучването, са достъпни от съответния автор при разумна заявка.

Резюме

Индуцирано от хипероксия остро нараняване на белия дроб (HALI) като едно от най-честите усложнения в патентите за механична вентилация и понастоящем няма ефективни методи за преодоляване на това. Предполага се, че микроРНК 21-5p (miR-21-5p) може да насърчи оцеляването на алвеоларните епителни клетки тип II (AECII), облекчавайки HALI. Настоящото проучване имаше за цел да комбинира анализа на генни чипове с свръхекспресия miR-21-5p, за да разработи нова терапевтична опция за HALI. Установено е, че AECII апоптозата е важно патогенно събитие в развитието на HALI и свръхекспресията на miR-21-5p предотвратява HALI, свързана с намаляване на AECII апоптозата. Тези резултати са получени при използване на аденовирусни/лентивирусни вектори, които свръхекспресират miR-21-5p, за трансфекция на AECII клетки in vitro и in vivo. Установено е, че свръхекспресията на miR-21-5p намалява апоптотичната скорост на AECII клетките. В допълнение, miR-21-5p намалява съотношението на свързан с В-клетъчен лимфом 2 (Bcl-2) X протеин/Bcl-2 и експресията на каспаза-3. Също така беше разкрито, че свръхекспресията на miR-21-5p облекчава острото нараняване на белите дробове при възрастни плъхове, изложени на хипероксична среда. Тези резултати предполагат, че miR-21-5p може да се превърне в нова терапевтична възможност за пациенти с HALI, чрез защита на AECII клетките от апоптоза.

Въведение

Материали и методи

Материали

В първия експеримент, AEC-II клетки от плъхове бяха предоставени от Централната лаборатория на Медицинското училище Xiangya (Чангша, Китай). Клетките се възстановяват и субкултивират и когато се култивират в среда RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) при 37 ° С за 36 h, културата се разделя на две групи. В групите за увреждане на H2O2 се добавя 0,5/1 H2O2 и култивирането продължава; в празната контролна група се добавя същия обем физиологичен разтвор и култивирането продължава.

Във втория експеримент общо 160 плъха на Sprague-Dawley (SD) (

180–220 g; мъжки и женски неформалност) бяха предоставени от Експерименталния център за животни към Третия военномедицински университет [Чунцин, Китай; номер на лиценз за животни: SCXK (Чунцин) 2012-0005]. Плъховете се поддържат при 18–22 ° C, относителна влажност от 50–60% и 12-часов цикъл светлина/тъмнина със свободен достъп до чау-плъх и вода. Плъховете бяха разделени на случаен принцип в четири групи: i) нормална контролна група (2,5% пентобарбитал натрий чрез анестезия на коремната кухина); ii) PBS група (2,5% пентобарбитал натрий чрез анестезия на коремната кухина и приложение на 200 µl PBS през капка в носа); iii) Празна вирусна група, (2,5% натриев пентобарбитал чрез анестезия на коремната кухина и приложение на 200 µl бавен вирус през капка в носа); iv) miRNA-21-5p група (2,5% пентобарбитал натрий чрез анестезия на коремната кухина и приложение на 200 µl бавен вирус, съдържащ miRNA-21-5p през капка в носа). Моделът с високо кислородно остро увреждане на белия дроб е установен и във всичките четири групи (всяка n = 40), в съответствие с предишно проучване (19). Всички плъхове, умрели в процеса на моделиране, бяха изключени от експеримента.

В третия експеримент субкултивираните AEC-II клетки бяха разделени на случаен принцип в четири групи: Нормална контролна група (физиологичен разтвор), H2O2 увредена група (0,5 mmol/l H2O2), miR-21-5p свръхекспресионна група (аденовирусен вектор с miR-21 -5p + 0,5 mmol/l H2O2), miR-21-5p отрицателна трансфекционна група (празен аденовирус + 0,5 mmol/l H2O2). Показателите бяха измерени съответно на 6, 12, 24 и 48 часа.

Откриване на AEC-II

Използването на трансмисионна електронна микроскопия (TEM) за откриване на ламеларен корпусмичен осмий се счита за златен стандарт за идентификация на AEC-II. Образците са идентифицирани с помощта на електронна микроскопия в Центъра за електронна микроскопия на Медицинския колеж Zunyi (Zunyi, Китай).

Морфологично откриване на апоптоза

Клетките на модела H2O2 се събират 24 часа след инкубация с 0,5 mmol/1 H2O2 за 24 часа. Впоследствие ТЕМ се използва за откриване на апоптотична морфология, като се използва същия метод, както е описан по-горе за AEC-II идентификация.

Откриване на ранна апоптотична скорост

Във всяка група клетките бяха събрани в пет времеви точки: Преди моделиране (T0) и 2.5, 6, 12 и 24 h след моделиране (T2.5, T6, T12 и T24, съответно) за приготвяне на едноклетъчни суспензии . Клетките се центрофугират при 4 ° С и 125 х g за 5 минути, супернатантата се изхвърля и клетките се измиват веднъж с PBS.

Скрининг на генни чипове и биоинформатичен анализ на свързани с апоптоза miRNAs

Клетките бяха събрани от T0 и T24 клетъчните групи, за да се извърши miRNA микрочипа, за да се сравни профилът на диференциална експресия на miRNAs между двете времеви точки и за скрининг, свързани с апоптоза miRNAs. Количеството РНК беше измерено с помощта на NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Inc.) и пробите бяха етикетирани с помощта на miRCURY LNA ™ microRNA Array Hi-Power Labeling Kit (Qiagen, Inc., Germantown, MD, USA), последвано от хибридизация върху miRCURY LNA ™ miRNA масив (версия 18.0; Qiagen, Inc.). Слайдовете бяха измити преди сканиране със скенер за микрочипове Axon GenePix 4000 B (Molecular Devices, LLC., Sunnyvale, CA, USA). След това сканираните изображения бяха импортирани в програмата GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, LLC.) За подравняване на мрежата и извличане на данни. Репликираните miRNAs бяха осреднени и miRNAs с интензитет> 50 във всички проби бяха използвани за изчисляване на нормализиращ фактор. Изразените данни се нормализират чрез средна нормализация. След това, miRNAs, които бяха значително диференцирано изразени, бяха идентифицирани чрез вулканичен парцел. И накрая, беше извършено йерархично клъстериране, за да се определят разликите в профилите на експресия на miRNA сред пробите, използвайки софтуера WebMeV (версия 4.6; http://mev.tm4.org/) (20).

За по-нататъшно изследване на функционалните роли на miRNA, предполагаемите цели на miR-449a-5p, miR-34b/c-5p и miR-21-5p бяха предвидени от TargetScan (http://www.targetscan.org/), miRecords (http://c1.accurascience.com/miRecords/) и бази данни miRTarBase (http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php).

Валидиране на верижна реакция с обратна транскрипция-полимеразна верига (RT-PCR) на свързани с апоптоза miRNAs

Установяване на модела на хипероксия на белодробно нараняване

Резервоарът с високо съдържание на кислород включваше контейнер от плексиглас (45 × 30 × 35 см) с кислороден съединител отгоре и кислороден детектор. SD плъховете се поставят в резервоара с висок кислород, вътрешната температура се поддържа на 25–27 ° C и влажност 50–70%, дебитът на кислорода се регулира така, че концентрацията на кислород вътре се поддържа на ≥90%. Содената вар в резервоара се използва за абсорбиране на CO2, за да се поддържа концентрацията на CO2 3), след което се използва флуоресцентна микроскопия за наблюдение на разпределението на зелената флуоресценция. Същият метод беше използван за прилагане на капки от същите дози PBS и лентивирус, които бяха използвани като контролна група.

Оптималният титър за трансфекция включва шест титра от 200 µl летивирусен разтвор (1 × 10 6, 2 × 10 6, 4 × 10 6, 6 × 10 6, 8 × 10 6 и 10 × 10 6 TU/ml) чрез назално вливане в белите дробове на плъхове. Промените в белодробната тъкан се наблюдават като цяло и с помощта на флуоресцентна микроскопия за наблюдение на промени във флуоресценцията на белодробната тъкан. Концентрацията, при която не се наблюдава увеличаване на плътността на флуоресценция, се счита за оптимален титър на трансфекция, в допълнение към увеличения титър на трансфекция.

Откриване на дихателни параметри

При моделните плъхове на 0, 24, 48 и 72 часа се извлича артериална кръв за газов анализ и индексът на оксигенация (OI) и дихателният индекс (RI) се изчисляват съгласно следната формула въз основа на резултатите от анализа на кръвните газове: OI = PaO2/FiO2. PaO2 е артериалното налягане на кислорода, FiO2 е фракцията на вдъхновения O2 или концентрацията на вдъхновен кислород. FiO2 беше регистриран като 90%. RI = P (A-a) O2/PaO2. P (A-a) O2 е градиентът на напрежението на алвеоларно-артериалния кислород (алвеоларно-артериална разлика в кислорода).

Леко микроскопско изследване на белодробна тъкан и патологично точкуване

Образци на тъкани са получени от плъхове с високо съдържание на кислород 0, 24, 48 и 72 часа, съответно, след жертването. Проба от 0,3 × 0,3 × 0,5 cm 3 от дясната белодробна тъкан беше фиксирана в 10% формалинова течност, дехидратирана, вградена в парафин и нарязана на 5–8 µm участъци, с обезпаразитяване на диметилбензола след оцветяване с хематоксилин и еозин. Секциите бяха отново дехидратирани, изчистени в ксилол и каучук, след което патологичните промени в белодробните тъкани бяха наблюдавани с микроскоп Leica DM4M (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Германия). Всяка тъканна биопсия беше оценена в три произволно избрани полета с висока мощност (увеличение, × 400) и средната стойност беше изчислена с помощта на система за точкуване (22,23), според структурното увреждане и възпалителната клетъчна инфилтрация в белодробната тъкан.

Определяне на тегловно съотношение белодробна тъкан влажно/сухо (Ш/Д)

Плъховете бяха отгледани във високо кислород за 0, 24, 48 и 72 часа, съответно, и умъртвени. Левият бял дроб се отстранява и претегля, за да се определи теглото на белия дроб. След това белодробната тъкан се поставя в пещ с постоянна температура при 80 ° С за 48 часа, докато теглото е постоянно, и се записва като сухо тегло на белия дроб. Съотношението W/D се изчислява въз основа на горните данни.

AEC-II трансфекция

Логаритмичните клетки от фазата на растеж се засяват в платки с шест ямки (5 × 10 7 клетки/cm2), докато клетките покрият дъното на ямката, след което 0,125% трипсин/EDTA се използва за смилане на клетките и се отчита. Аденовирусна течност (10 µl) се добавя към 10 ml без серум 1640 средна разреждане, определя се оптималната множественост на инфекцията (MOI). След успешна трансфекция с Lipofectamine ® 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), беше определена най-високата времева точка на ефективност на трансфекция според излъчената зелена флуоресценция.

RT-PCR анализ на miR-21-5p

Праймерите miR-21-5p са проектирани от Beijing Booheng Kechuang Biological Technology Co., Ltd. (Пекин, Китай) за обратна транскрипция на AEC-II с най-високо време за ефективност на трансфекция във всяка група. RT-PCR анализът беше извършен, както е описано по-горе, за да се открие експресията на miR-21-5p във всяка група, с U6 като вътрешен контрол.

Откриване на ранни апоптотични клетки с поточна цитометрия (FCM)

Оптималният MOI е 30. Свръхекспресията и отрицателните miR-21-5p аденовирусни вектори бяха трансфектирани в AEC-II и след успешна трансфекция клетките бяха подложени на нараняване от 0,5 mmol/l H2O2 за 6, 12, 24 и 48 часа . За всяка точка от времето всяка клетъчна суспензия се приготвя чрез центрофугиране в продължение на 5 минути при 4 ° С и 125 х g, отстраняване на супернатанта и промиване веднъж в PBS. Съгласно процеса на двойното маркиране на FCM, бяха определени ранните апоптотични нива на клетките.

Western blot анализ на експресията на Bcl-2, Bax и Caspase-3

Клетките AEC-II на 48 h след трансфекцията бяха поставени в ЕР епруветки, измити два пъти с PBS, добавени към клетъчния лизат, подложени на ултразвуково разрушаване и центрофугирани. Екстракцията на цели протеини се извършва чрез кипене при 100 ° С в продължение на 5 минути. Концентрацията на протеин беше определена с теста за протеин на бицинхонинова киселина. Протеините (50 ug/лента) бяха разделени и разделени с 10% SDS-PAGE и прехвърлени в мембрани от поливинилиден флуорид (PVDF). След блокиране в 5% обезмаслен млечен разтвор при стайна температура в продължение на 2 часа, мембраните се сондират с анти-Bcl-2 (1: 1000; кат. №1111115; Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-Bax (1: 1000, котка № ab77566; Abcam), анти-каспаза-3 (1: 1 200; котка № ab13585; Abcam) и анти-β-актин (1: 500; котка № ab8226; Abcam) първични антитела при 4 ° C през нощта. Впоследствие PVDF мембраните бяха инкубирани с конюгирани с пероксидаза от хрян вторични антитела (1: 2000; кат. № ab6728; Abcam) при стайна температура за 1 h. За визуализиране на лентите беше използван подобрен хемилуминесцентен субстрат (GE Healthcare, Чикаго, Илинойс, САЩ), който беше анализиран чрез система ChemiDoc MP (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Нивата на протеини бяха нормализирани до β-актин.