РЕЗЮМЕ

Развитието на мастната тъкан е строго регулирано чрез промяна на генната експресия. МикроРНК са силни посттранскрипционни регулатори на диференциацията на бозайниците. Ние предположихме, че микроРНК могат да повлияят на човешката адипогенеза чрез насочване към специфични адипогенни фактори. Идентифицирахме микроРНК, които показаха различно изобилие по време на диференциацията на човешките преадипоцити в адипоцити. Сред тях miR-130 силно повлиява диференциацията на адипоцитите, тъй като свръхекспресията на miR-130 нарушава адипогенезата и намалява miR-130 засилената адипогенеза. Ключов ефектор на действията на miR-130 беше протеиновият пероксизомен пролифератор-активиран рецептор γ (PPARγ), основен регулатор на адипогенезата. Интересното е, че miR-130 мощно потиска експресията на PPARy чрез насочване както към PPARy mRNA, кодираща, така и към 3 'нетранслирани области. Мастната тъкан от жени със затлъстяване съдържа значително по-ниски miR-130 и по-високи нива на PPARγ mRNA от тези при неносещи жени. Нашите открития разкриват, че miR-130 намалява адипогенезата чрез потискане на биосинтеза на PPARγ и предполагат, че смущения в този регламент са свързани с човешкото затлъстяване.

Освен транскрипционните фактори, които модулират адипогенезата, нараства разпознаването на посттранскрипционни регулаторни фактори като РНК-свързващи протеини (RBP) и микроРНК (miRNA), които модулират стабилността и транслацията на иРНК, кодиращи адипогенни фактори. Например, в началото на адипогенезата, RBP HuR селективно насърчава експресията на целевите иРНК, кодиращи C/EBPβ (13); C/EBPβ от своя страна допринася за увеличаване на експресията на други адипогенни фактори като PPARγ и C/EBPα (39, 40). Показано е също така, че RBP CUGBP1 модулира адипогенезата чрез свързване на C/EBPβ иРНК и подобряване на транслацията на обогатена на черния дроб инхибиторен протеин (LIP) изоформа на C/EBPβ (17).

МикроРНК са малки некодиращи РНК, които се свързват с РНК-индуцирания шумозаглушаващ комплекс (RISC) и свързват целеви иРНК с частична комплементарност. МикроРНК обикновено потискат експресията на прицелната иРНК чрез намаляване на нейната стабилност и/или транслация (3). Чрез своето влияние върху целевите иРНК, микроРНК участват в множество физиологични и патологични процеси, като развитие на тъкани, клетъчна пролиферация, апоптоза, енергиен метаболизъм, имунен отговор и туморогенеза (2, 21, 32). Някои микроРНК са идентифицирани като диференцирано експресирани по време на адипогенезата, включително няколко микроРНК, които променят клетъчната пролиферация (например, miR-24, miR-31 и miR-17-92 клъстер), потискат Wnt сигнализирането (miR-8) или целева PPARγ експресия (miR-27) (16, 18-20, 25, 33, 38).

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

РНК анализ. Общата РНК се приготвя директно от клетките или тъканите, използвайки колони Trizol (Invitrogen) или Qiagen, съгласно протоколите на производителите. След RT, използвайки произволни хексамери и SSII обратна транскриптаза (Invitrogen), изобилието от транскрипти се изследва чрез RT-qPCR, използвайки SYBR зелена PCR главна смес (Приложни биосистеми) и специфични за гена набори праймери (по-долу). RT-qPCRs бяха извършени на приложни модели 7300 и 7900 на Applied Biosystems.

Използваните съответно праймери и реверсивни праймери бяха както следва (последователност, 5 '→ 3'): адипонектин, GGCATGACCAGGAAACCAC и TTCACCGATGTCTCCCTTAGG; миши адипонектин, TGTTCCTCTTAATCCTGCCCA и CCAACCTGCACAAGTTCCCTT; лептин, GAACCCTGTGCGGATTCTTGT и TCCATCTTGGATAAGGTCAGGAT; GAPDH, TGCACCACCAACTGCTTAGC и GGCATGGACTGTGGTCATGAG; мишка GAPDH, AGGTCGGTGTGAACGGATTTG и TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA; PPARγ, GCTGTGCAGGAGATCACAGA и GGGCTCCATAAAGTCACCAA; мишка PPARγ, TCGCTGATGCACTGCCTATG и GAGAGGTCCACAGAGCTGATT; FABP4, AACCTTAGATGGGGGTGTCCTG и TCGTGGAAGTGACGCCTTTC; LPL, CTGGACGGTAACAGGAATGTATGAG и CATCAGGAGAAAGACGACTCGG; адипсин, CAAGCAACAAAGTCCCGAGC и CCTGCGTTCAAGTCATCCTC; миши адипсин, CATGCTCGGCCCTACATGG и CACAGAGTCGTCATCCGTCAC; GLUT4, TCAACAATGTCCTGGCGGTG и TTCTGGATGATGTAGAGGTAGCGG; PPARγ, ATCGCTCGAGGAAAGCCTTTTGG и CGCCGGATCCGAATAATGACAGC; PPARγ-UTR, ATTCCTCGAGACTAGCAGAGAGTCCTG и GAGCGGATCCCATATTCTAAAACCTTT; мишка aP2, GGGGCCAGGCTTCTATTCC и GGAGCTGGGTTAGGTATGGG.

микроРНК масив qPCR (анализ на miRNome) и откриване на микроРНК. Анализът на микроРНК qPCR е извършен с помощта на комплекта за профилиране на микроРНК hsa-miRNome (System Biosciences), за да се изследва експресията на miRNA в преадипоцити и адипоцити от два различни донора. Два микрограма РНК бяха обратно транскрибирани с помощта на QuantiMir RT комплект (System Biosciences) и профилирането на miRNA беше извършено чрез qPCR, използвайки микроРНК-специфични праймери и SYBR зелена PCR главна смес (Applied Biosystems). Нивата на експресия в пробите бяха нормализирани до експресия на U6. Промяната на гънките показва нивото на експресия на микроРНК от адипоцити спрямо нивото на преадипоцитите.

Отделни микроРНК бяха допълнително количествено използвани с помощта на тест за откриване на микроРНК на TaqMan (Applied Biosystems) или cDNA комплект QuantiMir (System Biosciences). За анализа на TaqMan за микроРНК откриване, специфични за miRNA комплекти праймери, предоставени от производителя, бяха използвани в RT-qPCR. За анализ на кДНК QuantiMir, праймерите бяха проектирани да бъдат точни последователности на miRNAs в базата данни miRBase и от комплекта беше използван универсален обратен праймер.

EGFP репортери, съдържащи PPARy mRNA последователности. Репортерите на EGFP бяха клонирани чрез вмъкване на специфични фрагменти от PPARγ 3′-UTR и CR в 3′-UTR и CR на pEGFP-C1 (BD Bioscience), както е описано по-горе (1). Областите на засяване на места за свързване на miR-130 върху иРНК на PPARy са мутирани чрез насочена към сайта мутагенеза (Stratagene).

Western blot анализ. Целоклетъчните лизати се приготвят с помощта на буфер за радиоимунопреципитация (RIPA), разделени чрез електрофореза в SDS-съдържащи полиакриламидни гелове и прехвърлени върху мембрани от поливинилиден дифлуорид (PVDF) (Millipore). Инкубациите с първични антитела за откриване на PPARy или GFP (Santa Cruz Biotech), или глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) или β-актин (Abcam), са последвани от инкубации с подходящите вторични антитела, конюгирани с хрянова пероксидаза (HRP) и чрез откриване с помощта на засилена луминесценция (GE Healthcare).

РЕЗУЛТАТИ

Диференциално експресирани miRNAs по време на човешката адипогенеза. (А) Схематичен поток от анализ на miRNome (вж. Материали и методи) за сравняване на профилите на експресия на микроРНК в преадипоцити и в напълно диференцирани адипоцити от двама отделни субекти. (B) МикроРНК, регулирани надолу в диференцирани адипоцити (пълен списък на микроРНК може да бъде получен от авторите). Удебелените микроРНК бяха изследвани допълнително. (C) нивата на експресия на miR-130 бяха анализирани чрез RT-qPCR анализ на 5 отделни донори, използвайки специфични за miR-130 комплекти праймери; *, P Модел на човешката адипогенеза. За да се изследва дали miR-130a и miR-130b са ​​повлияли на диференциацията на човешките адипоцити, ние изследвахме процеса на адипогенеза, използвайки преадипоцити, получени от отделни човешки донори. Преадипоцитите (> 90% от клетъчния препарат, както е описано в Материали и методи) са били подложени на стандартен протокол за диференциация, което е довело до тяхното диференциране в зрели адипоцити до ∼ ден 10 (Фиг. 2А). По време на този процес те постепенно натрупват липидни капчици, които се визуализират с помощта на маслено червено О (фиг. 2В), произвеждат нарастващи количества триглицериди (фиг. 2С) и изразяват нарастващи концентрации на FABP4 и GLUT4 иРНК, два класически маркера на зрели адипоцити ( Фиг. 2D).

Модел на диференциация на човешките адипоцити. (А) Схема на преадипоцитна трансфекция и диференциация в зрели адипоцити. Преадипоцитите бяха стимулирани да се диференцират на ден 1 и завършиха диференциацията до ∼ ден 10. (B) Образуването на липидни капчици беше наблюдавано чрез светлинна микроскопия и чрез оцветяване с маслено червено O. (C) Концентрацията на триглицеридите (TG) беше измерена, както е описано в Материали и методи. (D) Изобилието от иРНК на FABP4 и GLUT4 се нормализира до нивата на иРНК на GAPDH. В панели C и D данните представляват средните стойности + SD за трима отделни донори, всеки анализиран в три екземпляра.

В тази система измерихме зависимия от времето спад в нивата на miR-130a и miR-130b (Фиг. 3А). Сред тРНК, показващи повишена експресия по време на човешката адипогенеза (фиг. 3В), се предсказва, че PPARy иРНК е мишена на miR-130a и miR-130b. В добре установен модел на миша адипогенеза (3T3-L1 преадипоцити, диференциращи се в адипоцити), има подобен спад в консервираните миши miR-130a и miR-130b и съпътстващо увеличение на иРНК, кодиращи специфични за адипоцитите протеини (фиг. 3С и D). Паралелните промени в човешки и миши мРНК и miR-130 по време на адипогенеза допълнително подкрепят пригодността на модела на човешка адипогенеза.

Сравнение на модели на човешка и миша адипогенеза. (A и B) Нивата на miR-130a и miR-130b (A), както и PPARy mRNA и няколко адипогенни маркери транскрипти (B), бяха измерени в човешки преадипоцити, подложени на протокол за диференциация, както е описано в легендата на Фиг. 2. (C и D) Нивата на miR-130a и miR-130b (C), както и PPARy mRNA и няколко адипогенни маркери транскрипти (D), бяха измерени по време на диференциацията на 3T3-L1 миши преадипоцити. Данните представляват средните стойности ± SD на три независими експеримента.

Промяната на нивата на miR-130 модулира диференциацията на адипоцитите. За да се установи дали намаляването на нивата на miR-130a и miR-130b влияе върху диференциацията на адипоцитите, имитациите на miR-130a и miR-130b бяха трансфектирани отделно в преадипоцити, които след това бяха подложени на протокола за диференциация (Фиг. 2А). Тази интервенция доведе до значително нарушение на диференциацията, както се определя от морфологичните промени и оцветяването с масло в червено (фиг. 4А и данните не са показани) и намалено производство на TG (фиг. 4Б). Обратно, намаляването на miR-130a или miR-130b чрез трансфекция на антисенс (AS) олигонуклеотиди, комплементарни на miR-130a и miR-130b („антагомири“), подобрява диференциращия фенотип (фиг. 4А) и увеличава съдържанието на TG (фиг. 4В) . Изобилието на miR-130 след трансфекция е показано на фиг. 4С. До 24 часа (ден 1) след трансфекция, свръхекспресията на miR-130a е ∼150 пъти по-висока и miR-130b е ∼400 пъти по-висока; до 24 часа след трансфекция на антагомирите, нивата на miR-130a са с ∼60% по-ниски и нивата на miR-130b са ​​с 50% по-ниски (фиг. 4С). Трябва да се отбележи, че антагомирите могат да неутрализират микроРНК, без да намаляват активно тяхното изобилие в стационарно състояние, така че концентрацията на функционална miR-130 след (AS) miR-130a/b трансфекция е вероятно по-ниска от тази, измерена чрез RT-qPCR.

Диференциално изразяване на miR-130 при слаби и затлъстели жени. (А) Таблица, предоставяща информация за отделните жени донори, от които е използвана коремна мазнина за приготвяне на иРНК. Донорите бяха или слаби (BMI 25). (B) Нивата на PPARy mRNA (вляво, нормализирано до GAPDH mRNA), miR-130a и miR-130b (вдясно, нормализирано до U6) бяха измерени чрез RT-qPCR анализ; разликите между слабите и затлъстели жени са били значителни (*, P Получено на 2 август 2010 г.

  • Върнато за промяна на 1 септември 2010 г.
  • Приет на 18 ноември 2010 г.
  • Приет ръкопис, публикуван онлайн на 6 декември 2010 г.

    • mir-130