РЕЗЮМЕ

ВЪВЕДЕНИЕ

Глобалната епидемия от затлъстяване значително повиши изследователския интерес към мастната биология, особено тази на разсейващата енергията кафява мазнина (1). Докато бялата мастна тъкан (WAT) съхранява излишната химическа енергия, което води до увеличаване на теглото, кафявата мастна тъкан (BAT) изразходва енергия като топлина чрез несвързано дишане чрез действието на митохондриален несвързан протеин 1 (UCP1), предпазвайки от хипотермия и затлъстяване (2– 5). Неотдавнашни проучвания откриха втори вид кафявоподобна мазнина, „бежова мазнина“, която присъства в WAT и е генетично различна от класическата НДНТ (6). Интересното е, че скорошни проучвания при хора с използване на 2-флуородеоксиглюкоза, съчетани с позитронно-емисионна томография (PET), показват, че възрастните хора имат кафява мазнина и че дейностите и количествата кафява мазнина са обратно свързани с индекса на телесна маса (ИТМ) и значително намаляват в затлъстяване (3, 7). Увеличаването на енергийните разходи чрез насърчаване на производството на кафява мазнина в НДНТ, а също и бежова мазнина в WAT, особено при лица със затлъстяване, би било привлекателна възможност за намаляване на теглото и за лечение на заболявания, свързани със затлъстяването.

Депата с кафяви и бежови мазнини се развиват в отговор на различни активатори, включително излагане на студ, хормони, упражнения и регулатори на транскрипцията, като PRDM16, PPARγ, SIRT1 и PGC-1α (8-11). Доказано е, че растежният фактор 21 на фибробластите (FGF21) влияе благоприятно на метаболизма и енергийния баланс чрез засилване на β-окисляването на мастните киселини по време на продължително гладуване, а също и чрез насърчаване на покафеняване на мазнините в WAT, както и в BAT, в отговор на излагане на студ при мишки ( 12–16). Важното е, че неотдавнашно проучване при хора показа, че излагането на студ повишава нивата на циркулация на активаторите на кафявите мазнини FGF21 и иризин и че лечението с който и да е от тези ендокринни регулатори регулира гените за покафеняване и стимулира термогенезата (17).

Новите доказателства показват, че микроРНК (miRs) също функционират като важни регулатори, които инхибират кафявото ремоделиране на адипоцитите. Обогатената с мускули miR-133a директно регулира експресията на ключовия транскрипционен активатор на диференциацията на кафявите мазнини, PRDM16 и излагането на студ намалява нивата на miR-133a и насърчава диференциацията на кафявите мастни клетки (18, 19). Обогатеният с кафяв адипоцит miR-155 също показа, че инхибира диференциацията на кафявите мастни клетки чрез директно насочване към транскрипционния фактор на кафявото C/EBPβ (20). Неотдавнашен анализ на профилиране на експресия на miR разкри, че нивата на miR-34a са повишени в адипоцитите от затлъстели индивиди (21), но функционалната роля на повишения miR-34a при затлъстяване остава неизвестна.

В това проучване ние показваме, че повишеният miR-34a при затлъстяване действа като инхибитор на образуването на бежови и кафяви мазнини. Лентивирусното медиирано понижаване на miR-34a при мишки с индуцирано от диетата затлъстяване увеличава маркерите на бежовата мазнина във всички видове WAT и насърчава допълнително покафеняване в BAT. В механистични проучвания показахме, че понижаването на регулирането на miR-34a повишава експресията на рецепторния комплекс FGF21 (FGFR1-βKL) и на SIRT1, допринасяйки за активирането на транскрипционната програма за покафеняване чрез FGF21/SIRT1-зависима деацетилиране на PGC-1α. Важно е, че в допълнение към зачервяването на мазнините в мастната тъкан, анти-miR-34a-медиираните благоприятни ефекти, включително намаленото затлъстяване, са вероятни от множество тъкани, тъй като регулирането на miR-34a подобрява чернодробната сигнализация FGF21 и експресията на гените за окисление на мазнините.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Реактиви и материали. Antisense miR-34a, анти-кодирана РНК, комплект за анализ на TaQMan miRNA и малки интерфериращи РНК (siRNAs) за βKL (s96291 и s96292), FGFR1 (s66023 и s66025) и SIRT1 (s96764 и s174220) са закупени от Applied . Антитела срещу βKL (AF2619) са закупени от R&D Systems. Закупени са антитела срещу FGFR1 (sc-121), SIRT1 (sc-15404), PGC-1α (sc-13067), РНК полимераза II (sc-9001), тубулин (sc-8085) и актин (sc-1616) от Santa Cruz Biotech и антитела за фосфорилирана извънклетъчна сигнално-регулирана киназа (p-ERK) (9101), t-ERK (4695), фосфорилирана AMP киназа (p-AMPK) (2531), t-AMPK (2532) и pan-acetyl-Lys (9441) са закупени от Cell Signaling Technology. Антитела за CD137 (ab64836) и UCP1 (ab10983 и MAB6158) са закупени от Abcam и R&D Systems. Комплект за количествено определяне NAD/NADH е закупен от Biovision. Антитела за βKL (LS-B3568) и FGFR1 (nb600-1287), използвани в проучвания за имунохистохимия (IHC), са закупени съответно от LS Biology и Novus Biological. Рекомбинантният FGF21 се експресира в Escherichia coli и се пречиства, както е описано по-рано (12).

IHC проучвания. Първичните антитела към UCP1 и CD137 бяха визуализирани с помощта на белязано с биотин вторично антитяло и свързан с пероксидаза комплект стрептавидин (Abcam), а пробите бяха изобразени с NanoZoomer скенер (Hamamatsu). За флуоресценция IHC бяха използвани вторични антитела, маркирани с Alexa Fluor 647 или 488. Ядрото се оцветява с DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол; Invitrogen). Пробите са изобразени чрез конфокална микроскопия (Zeiss LSM 700).

Номер на копие на митохондриална ДНК. Общата ДНК се изолира с помощта на комплект за екстракция на ДНК (Omega Bio-Tek). Изготвя се стандартна крива на серийно разреждане и ДНК се определя количествено чрез количествена PCR (qPCR). Броят на копията на митохондриалната ДНК се изчислява от съотношението на ДНК на гена COX II, митохондриален ген, към този на гена на циклофилин А, ядрен ген с едно копие.

Анализ на активността на CS. Активността на митохондриалната цитрат синтаза (CS) се измерва чрез използване на комплект (Sigma-Aldrich) в съответствие с инструкциите на производителя. За анализа бяха използвани общо 1 до 2 μg протеин от подкожна ингвинална WAT (scWAT), гонадна WAT (gWAT) или BAT.

NAD + и NADH измервания. Нивата на NAD + и NADH бяха измерени чрез техните ензимни реакции в съответствие с инструкциите на производителя (Biovision, Inc.), както е описано по-рано (23).

Диференциация на 3T3-L1 клетки. 3T3-L1 клетки се култивират в М1 среда (модифицирана от Dulbecco среда на Eagle's [DMEM], 10% фетален говежди серум [FBS], 4,5 mg/ml глюкоза, 4 mM глутамин и 1 mM натриев пируват). Два дни след като клетките достигат сливане, дидиференциацията на адипоцитите се предизвиква чрез добавяне с М2 среда (М1 среда, съдържаща 0,5 тМ 3-изобутил-1-метилксантин, 1 цМ дексаметазон и 1,5 µg/ml инсулин). Два дни по-късно средата беше заменена с М3 среда (М1 среда, съдържаща 1,5 μg/ml инсулин). Средата M3 се подменяше на всеки 2 дни. Диференциацията на 3T3-L1 мастните клетки беше потвърдена чрез оцветяване с Oil Red O.

Измерване на скоростта на консумация на кислород. Диференцирани 3Т3 клетки бяха трансфектирани с анти-miR-34a олигонуклеотид и 48 часа по-късно беше добавена палмитинова киселина (2 тМ). Клетките се третират допълнително на интервали от 30 минути с олигомицин (14 μM), фармакологичен разединител FCCP (10 μM) или инхибитор на комплекс III и I антимицин А (4 μM [всеки]). Скоростта на консумация на кислород е измерена с XF анализатор (Seahorse Bioscience, Inc.).

Изграждане на Fgfr1 3′UTR-luc плазмиди и анализ на луцифераза. SpeI/HindIII фрагмент, съдържащ 3 'нетранслиран регион (3'UTR) на FGFR1, беше амплифициран и вмъкнат в pMIR плазмида. Мутациите са направени чрез насочена към сайта мутагенеза и са потвърдени чрез ДНК секвениране. Анализите на луцифераза се извършват, както е описано по-рано (23-25).

qRT-PCR. МикроРНК се изолират с помощта на комплект за изолиране на miRNA (Ambion). Нивата на miR-34a се определят чрез количествена обратна транскрипция-PCR (qRT-PCR) и се нормализират до snoRNA202. За нивата на иРНК общата РНК се изолира с TRIzol и нивата се определят чрез qRT-PCR, нормализиран до 36В4. Последователностите на грундовете са налични в таблица S1 в допълнителния материал.

PGC-1α тестове за ацетилиране и ChIP. WAT тъканите се събират от 3 мишки и се приготвят екстракти и веднага се използват за анализи на ацетилиране на имунопреципитация (IP) и имуноблотинг (IB), както е описано по-горе (23-25). IP буферът съдържа 1 μM трихостатин А (TSA) и 10 mM N-ацетилмураминова киселина (NAM), за да инхибира деацетилирането. Комбинирани експерименти против miR-34a и siRNA бяха проведени в 3T3-L1 адипоцити, за да се определят ефектите от FGFR1, BKL, SIRT1 и miR-34a върху FGF21 сигнализиране, AMPK активиране, PGC-1α деацетилиране и номер на копие на митохондриална ДНК. Ефектите върху заетостта на PGC-1α и РНК полимераза II при покафеняване на гени се определят чрез хроматин IP (ChIP), както е описано по-рано (23-25).

РЕЗУЛТАТИ

Понижаването на регулирането на miR-34a насърчава производството на бежово подобно на мазнини във всички видове WATs при мишки с индуцирано от диетата затлъстяване. Резултатите от IHC оцветяването показват бежовия маркер за специфични клетки CD137 (червен), маркера за покафеняване UCP1 (зелен) и обединени изображения за gWAT, prWAT и scWAT (A до C) и за BAT (D) от мишки, хранени с BALB/c ND или HFD и инжектиран с контролен лентивирус (LE) или лентивирус, експресиращ анти-miR-34a (L-34ai).

miR-34a инхибира индуцираното от студена температура зачервяване на мазнините в адипоцитите на 3T3-L1. Последните данни показват, че miRs функционират като важни регулатори на ремоделирането на кафява мазнина в отговор на излагане на студ (18, 19). Тъй като понижаването на регулирането на miR-34a при затлъстяване увеличава маркерите за бежови и кафяви мазнини, ние изследвахме ефектите от излагането на студ върху нивата на miR-34a и допълнително изследвахме потенциалната роля на miR-34a в експресията на маркера за потъмняване на мазнините UCP1 в диференциран 3T3- L1 адипоцити (фиг. 5А). Излагането на 3T3-L1 мастни клетки на студена температура значително намалява нивата на miR-34a и драстично увеличава броя на копията на митохондриалната ДНК (фиг. 5В и С). Нивата на mRNA на свързаните с кафявото гени Ucp1, Pgc-1a и Prdm16 и нивата на протеин на UCP1, открити от IHC, също бяха значително увеличени при излагане на студ (Фиг. 5D и E). Екзогенната експресия на miR-34a значително обърна всички тези ефекти, предизвикани от студена температура (Фиг. 5B до E). Тези резултати предполагат, че miR-34a може да функционира като общ инхибитор на покафеняването на мазнините не само при условията на затлъстяване, представени по-горе (Фиг. 1 до 4), но и при излагане на студ.

miR-34a инхибира индуцирания от студената температура маркер за кафява мазнина UCP1 в 3T3-L1 мастните клетки. (A) Експериментален контур за диференцирани 3T3-L1 адипоцити. (B до E) Ефекти от излагане на студ и медиирана от аденовирус експресия на miR-34a върху нивата на miR-34a (B), номер на копие на митохондриална ДНК (C), нива на mRNA на гени, свързани с покафеняване (D), и експресия на маркер за кафява мазнина UCP1, открит от IHC (E).

Нивата на адипоцитни miR-34a и FGFR1-βKL са обратно корелирани. След това разследвахме възможните механизми на анти-miR-34a-медиирано покафеняване на мазнини при затлъстели мишки. Последните проучвания показват, че FGF21 насърчава образуването на кафяви и бежови мазнини в адаптивна термогенеза (14, 17). Изненадващо, в 3'UTR на рецептора FGF21 (FGFR1) (фиг. 6А) беше открита запазена последователност на семена miR-34a. Освен това, в предишни проучвания, ние показахме, че miR-34a атенюира чернодробната FGF19 сигнализация чрез директно насочване към βKL (22). βKL е мембранният корецептор за FGF19 в черния дроб, но също така и за FGF21 в черния дроб и в мастната тъкан (31). Поради това предположихме, че miR-34a инхибира затлъстяването и покафеняването на мазнините поне отчасти, като насочва адипоцитния рецепторен комплекс FGF21 (FGFR1-βKL). Всъщност при WAT на затлъстели мишки е имало обратна корелация между експресията на miR-34a и FGFR1-βKL в WAT (фиг. 6В), а обратната корелация е била открита и в 3T3-L1 мастните клетки (фиг. 6C и D ), подкрепящи тази хипотеза.

miR-34a понижава регулирането на адипоцитния рецепторен комплекс FGF21, FGFR1-βKL, чрез директно насочване към 3′UTRs на гените. (А) Потенциални miR-34a целеви последователности в FGFR1 3′UTR последователности от различни видове. Показва се сдвояване на GC, AU и GU колебание на основата. (B) Нивата на miR-34a и на FGFR1 и βKL иРНК в WAT на мишки, хранени с ND или HFD, бяха открити чрез qRT-PCR. Данните са средни стойности и SEM (n = 6). **, P miR-34a отслабва сигнализирането на FGF21 чрез директно насочване към FGFR1. За да се определи дали FGFR1 е директна цел на miR-34a, свързващата последователност на miR-34a във FGFR1 3′UTR или мутирала последователност е вмъкната в репортер на луцифераза (Фиг. 6Е). Понижаването на регулирането на miR-34a повишава репортерната активност за дивия тип (WT) последователност, но не и мутиралата последователност, и обратно, свръхекспресията на miR-34a инхибира репортерната активност само за WT последователността (Фиг. 6F и G). Тези резултати показват, че miR-34a директно регулира FGFR1 и че инхибирането вероятно се медиира чрез свързване на miR-34a с 3'UTR на иРНК на FGFR1.

Понижаването на регулирането на miR-34a при диетично затлъстяване увеличава сигнализирането на FGF21. След това изследвахме ефектите на miR-34a върху сигнализирането на FGF21 чрез извършване на експерименти за увеличаване и загуба на функция в диференцирани 3T3-L1 мастни клетки. FGF21-медиираното фосфорилиране на ERK е мярка за отзивчивост на FGF21 (31, 32). Лечението с FGF21 повишава нивата на активиран p-ERK, но тези ефекти не се откриват в клетките, свръхекспресиращи miR-34a, и обратно, понижаването на регулирането на miR-34a повишава нивата на p-ERK (фиг. 7A и B), което показва, че miR-34a отслабва адипоцитна FGF21 сигнализация.

Anti-miR-34a повишава PGC-1α кафявата генна активност чрез FGF21/SIRT1-зависимо деацетилиране. (A) Експериментален контур за 3T3-L1 мастни клетки. (Б) Намалени нива на протеин чрез лечение с siRNA. (C до H) Ефекти от понижаване на регулирането на FGFR1, βKL или SIRT1 от siRNA върху нивата на p-ERK (C), нивата на p-AMPK (D), нивата на ацетилирани PGC-1α (E), PGC-1α при зачервяване на гени (F), нива на иРНК на гени за потъмняване (G) и номер на копие на митохондриална ДНК (H). Данните са средни и SEM (n = 3). *, P Получено на 30 април 2014 г.

  • Върнато за промяна на 19 май 2014 г.
  • Приет на 27 август 2014 г.
  • Приет ръкопис, публикуван онлайн на 2 септември 2014 г.

    • частично