Липсата на LTβR повишава чувствителността на клетките IPEC-J2 към свински епидемичен диария вирус

ibg.waykun.com - Диета и загуба на тегло, днес

Tawfeek Altawaty

1 Институт по животновъдни науки, Китайска академия на земеделските науки, Пекин 100193, Китай; moc.liamxof@keefwat (T.A.); moc.621@0902ululuil (L.L.); nc.saac@gnocoat (C.T.); nc.saac@auhoahsuoh (S.H.); nc.saac@iukil (К.Л.)

Лулу Лиу

2 Катедра по животновъдство, Китайски земеделски университет, Пекин 100193, Китай

Хонгйонг Джанг

3 Държавна ключова лаборатория по репродуктивна биология, Институт по зоология, Китайска академия на науките, Пекин 100101, Китай; moc.361@648gnoygnohgnahz

Конг Тао

Шаохуа Хоу

Куй Ли

Янфанг Уанг

Свързани данни

Резюме

1. Въведение

Лимфотоксин бета рецепторът (LTβR) принадлежи към суперсемейството на рецептора на туморния некротичен фактор (TNF) (TNFRSF), което включва повече от 25 рецептора, които взаимодействат с близо 20 лиганда за регулиране на имунния отговор, и се активира от възпалителните цитокини лимфотоксин α1β2 или TNF член на суперсемейство 14 (TNFSF14, наричан още ЛЕКЛО) [1]. LTβR се експресира на повърхността на повечето клетъчни типове, с най-висока експресия върху клетки от епителни и миелоидни линии [2].

Наскоро бяха използвани условни нокаутиращи модели мишки, за да разкрият нови клетъчни функции на LTβR. Въздействията на LTβR върху развитието на лимфните възли (LN) и микросредата на съдовата LN бяха разкрити от специфични за ендотелните клетки клетъчни мишки LTβR и това проучване идентифицира ендотелните клетки като важен организатор на лимфоидна тъкан, зависим от LTβR [9]. Освен това е демонстрирано, че LTβR сигнализирането в чревните епителни клетки е от съществено значение за производството на епителни IL-23 и защита срещу епителни увреждания [10]. Изследването на макрофаги/неутрофилни LTβR-специфични нокаутиращи мишки, които са генерирани от системата flox/LysM-cre, предполага, че LTβR активирането върху макрофаги от лимфотоксин α1β2, получен от Т-клетки, контролира провокативните реакции чрез трипартитния мотив протеин 30α (TRIM30α ) път за защита срещу обострящи се възпалителни реакции [11].

Свинският епидемичен вирус на диария (PEDV) се репликира ефективно в тънките черва [12], а PEDV инфекцията причинява остър, тежък атрофичен ентерит, включително лека до тежка водниста диария, дехидратация и повръщане при свинете. Съобщава се за тежки огнища на PEDV инфекции в Китай през 2010 г. [13] и в Северна Америка през 2013 г. [14], което води до висока смъртност сред заразените прасенца и огромни икономически загуби. Епителните клетки осигуряват първата линия на защита срещу лигавичните патогени, а IPEC-J2 клетките и LTβR сигнализирането в чревните епителни клетки са необходими за набирането на неутрофили до мястото на инфекцията по време на ранната инфекция чрез производството на лиганд хемокин (CXC мотив) 1 (CXCL1) и CXCL2 [15]. Понастоящем обаче значението на LTβR за регулирането на PEDV инфекцията в клетки IPEC-J2 е неизвестно. В това проучване генерирахме LTβR нокаут клетки, използвайки техниката CRISPR/Cas9 и изследвахме ефекта на LTβR върху клетъчната пролиферация на IPEC-J2, клетъчния цикъл и апоптозата. По-конкретно, въздействието на LTβR върху PEDV инфекцията в клетки IPEC-J2 също беше изследвано.

2. Материали и методи

2.1. Проби от свински черва

Тъканите на свинските черва, включително дванадесетопръстника, йеюнума, илеума, апендикса, дебелото черво, ректума и лимфните възли, бяха събрани от четири възрастни мъжки големи бели прасета (n = 4). Всички експерименти с животни са извършени съгласно процедурите, одобрени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните към Института по зоология на Китайската академия на науките (CAS) (Етичен номер на одобрение: IOZ20160047).

2.2. Клетъчна култура

Клетки от бъбреци на африканска зелена маймуна (Vero E6) се съхраняват в лабораторията на Shaohua Hou от Института по наука за животните (IAS), Китайската академия на земеделските науки (Пекин, Китай) и клетките IPEC-J2 са закупени от Jennio Biotech Co., Ltd. (Гуанджоу, Китай). И двете клетки бяха култивирани в Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), допълнени с 15% фетален говежди серум (FBS, HyClone, Logan, UT, USA) и 1% пеницилин-стрептомицин. И двата клетъчни типа се инкубират при 37 ° С с 5% СО2. Адаптираният към клетките Vero щам PEDV CV777, съхраняван в лабораторията на Hou от IAS, се размножава, както е описано по-рано [16].

2.3. Насочване на гени от системата CRISPR/CAS9

2.4. PCR с обратна транскрипция (RT-PCR)

В това проучване са използвани две различни RT-PCR, PCR в реално време и полуколичествена PCR. Общата РНК от тъкани и клетки се изолира чрез реагент TRIzol и концентрациите на РНК се определят с апарат NanoDrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). Два милиграма от обща РНК бяха обратно транскрибирани с помощта на комплект за синтезиране на cDNA от първа верига (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). PCR в реално време се извършва с помощта на SYBR Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) и 7500 Fast PCR система в реално време (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Експресионните нива бяха нормализирани до тези на домакинския ген, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH). Праймерите, използвани за PCR в реално време, са показани в таблица 1. Относителната генна експресия се изчислява, използвайки метода на сравнителния праг на цикъла (2 -DDCt). Параметърът за полуколичествена PCR беше 4 минути при 94 ° C, последвани от 26 цикъла от 45 s при 94 ° C, 30 s при 60 ° C, 45 s при 72 ° C и окончателно удължаване от 5 минути при 72 ° C . PCR продукти (10 uL) бяха използвани за откриване на експресията.

маса 1

Грундове, използвани в това проучване.

Име на гена Напред (5′-3 ′) Обратно (5′-3 ′)

Лимфотоксин бета рецептор (LTβR)	CACTCATGCTGGGCCTCT	GAGCAGCAGACGTGATGTTT
Молекула на адхезия на съдови клетки 1 (VCAM1)	ATCCAAGCTGCTCCAAAAGA	GGCCCTGTGGATGGTATATG
Интерлевкин-22 (IL-22)	TTGCTCAAGTTCGTGTCGTC	GGTCAAGCTTGCAGTGATGA
Интерлевкин-23 (IL-23)	TAGGGGTCGAGTCAGAGGTG	GAGTGCCATCCTTGAGCTGT
Интерлевкин-6 (IL-6)	CCACCGGTCTTGTGGAGTTT	AGTCGGGTTGTCTAGGCTGA
Интерлевкин-8 (IL-8)	TGCAAGCTTTGTTATGCAGTG	GCCTGGTGAATTTTTGCTGT
Пролифериращ клетъчен ядрен антиген (PCNA)	GATTCCACCACCATGTTCGAG	GATTCCACCACCATGTTCGAG
Каспаза 3 (CASP3)	GCCATGGTGAAGAAGGAAAA	GTCCGTCTCAATCCCACAGT
Туморен фактор на некроза Superfamily member 10 (TNFSF10)	ACCCAAAGGCTCAACAC	CCCACCTGAGATGGATCACT
Глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH)	GTGAAGGTCGGAGTGAACG	CTCGCTCCTGGAAGATGGTG
Вирус на свинска епидемична диария (PEDV)	GCACTTATTGGCAGGCTTTGT	CCATTGAGAAAAGAAAGTGTCGTAG

2.5. Западно петно

Клетките се измиват два пъти със студен фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и пробите от лизат се приготвят в 350 μL T-PER Tissue Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA) в присъствието на протеазен инхибиторен коктейл (Roche, Индианаполис, IN, САЩ) и се центрофугира при 20 000 × g в продължение на 20 минути при 4 ° C.

Протеините (20–50 μg) и белтъчните маркери се разделят чрез SDS-полиакриламидна електрофореза в 10% полиакриламидни гелове и се прехвърлят в мембрани от поливинилиден дифлуорид (PVDF) (Millipore, Madison, WI, USA). Петната бяха блокирани в 5% мляко в 0,1% буфериран с Tris физиологичен разтвор-Tween 20 (TBST) за 1 h при стайна температура. След това петна се инкубират с антитела срещу LTβR (1: 1000, Abcam, Cambridge, МА, САЩ) и β-актин (1: 2000, CST, Danvers, МА, САЩ) за една нощ при 4 ° С. Имунореактивните ленти бяха открити с помощта на Western Blotting Substrate с усилена хемилуминесценция (ECL) (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA).

2.6. Клетъчно разпространение

За да се изследва клетъчната пролиферация, LTβR +/+ и LTβR -/- клетките се поставят в 96-гнездови плаки при 5 × 10 3 клетки на гнездо в 100 µL среда за клетъчна култура и се поддържат при 37 ° С в овлажнен инкубатор, съдържащ 5% CO2 . Пролиферацията се анализира на всеки 24 часа с комплект за преброяване на клетки-8 (комплект CCK-8, Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай) следвайки протокола на производителя.

2.7. Анализ на клетъчния цикъл

LTβR +/+ и LTβR -/- клетките се посяват в 6-ямкови плаки и серум гладуват за една нощ за синхронизация. На следващия ден се добавя серум към клетките и след 24 часа стимулация клетките се трипсинизират и фиксират в студен 70% етанол. След това клетките се инкубират при 4 ° С за минимум 45 минути до максимум една нощ. Впоследствие те се центрофугират при 1500 × g в продължение на 10 минути при 4 ° C и се суспендират отново в 0,4% пропидиев йодид (PI: съдържащ 50 μg/mL пропидум йодид със 100 μg/mL RNase A) за оцветяване. След това клетките бяха анализирани с цитометър LSR II (BD Biosciences, Сан Диего, Калифорния, САЩ) и интензивността на PI оцветяване беше определена от софтуера ModFit (BD Biosciences, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Този анализ дава процента на клетките във фазите G1, S и G2.

2.8. Цифрова холомониторна микроскопия

Микроскопията HoloMonitor M4 (Phase Holographic Imaging AB, Лунд, Швеция) е цитометър със закъснителен образ, базиран на холографска микроскопия, осигуряващ изображения и количествено определяне на незацапани живи клетки директно в техните културни съдове. LTβR +/+ и LTβR -/- клетки се посяват в 6-ямкови плаки и се наблюдават в продължение на 72 часа. Апоптозата е анализирана от софтуера за проследяване Hstudio M4 (Scheelevägen, Швеция).

2.9. Статистически анализ

Експресия на лимфотоксин бета рецептора (LTβR) в различни свински тъкани на червата. Тъкани, включително дванадесетопръстника, йеюнума, илеума, апендикса, дебелото черво, ректума и лимфните възли, бяха събрани от възрастни мъжки големи бели прасета (n = 4) и PCR в реално време беше използван за измерване на нивото на експресия на LTβR. * p -/- Клетки, използващи CRISPR/Cas9

За да генерираме LTβR нокаут IPEC-J2 клетки, ние проектирахме две различни sgRNAs (L1 и L3), които са насочени към 32 bp области в екзон 2 на свинския LTβR ген (Фигура 2 A). Плазмидът pCAG-GFP се трансфектира съвместно с плазмидите pX330-L1 и pX330-L3 и единичните клетки се сортират в 96-ямкови плаки чрез поточна цитометрия. За определяне на мутации, медиирани от CRISPR-CAS9, бяха избрани 96 колонии и подложени на RFLP анализ (Фигура 2 Б). Нашите данни показват, че 10 клетъчни клонинги са билиалелно мутирани и ефективността на насочване е 10,4% (Фигура 2 B, C). За по-нататъшно валидиране на биалелната мутация, пет клетъчни клонинги, 1-10 #, 1-19 #, 1-22 #, 2-3 # и 6-18 #, бяха произволно избрани за ДНК секвениране (допълнителна фигура S1) и резултатите потвърдиха тези на RFLP. Освен това бяха сравнени аминокиселинните последователности от дивия тип 1-10 # клетъчен клон и нашите резултати демонстрираха изместена мутация в двата алела (допълнителна фигура S2).

3.3. LTβR нокаут инхибира разпространението на клетки IPEC-J2

За да се изследва потенциалният ефект на LTβR върху клетъчната пролиферация, се използва комплект CCK-8 за анализ на клетъчната пролиферация както в LTβR +/+, така и в LTβR -/- клетки. Както е показано на Фигура 3А, in vitro пролиферацията на LTβR -/- клетки беше значително инхибирана на 48 h (0.387 ± 0.023 срещу 0.189 ± 0.018 за LTβR +/+ и LTβR -/- клетки, съответно, p +/+ и LTβR -/- клетки, съответно, p -/- клетки (Фигура 3 Б). Тези резултати предполагат, че нокаутът на LTβR намалява клетъчния растеж in vitro.

3.4. LTβR нокаут предизвиква IPEC-J2 клетъчна апоптоза

Цифровата холографска микроскопия предлага предимство при изучаване на наблюденията в реално време на критични събития, като показва непрекъсната двумерна (2D) и 3D визуална картина на клетъчната активност на втори интервали. Голямо портфолио от количествени морфологични параметри, включително обем на оптичната клетка, дебелина, площ, неравномерност, ексцентричност и проследяване на единични клетки, могат да бъдат записани и анализирани [20]. Тук е използвана цифрова холографска микроскопия за проследяване на динамични дейности и морфологични промени на LTβR +/+ и LTβR -/- клетки в реално време в продължение на 72 часа. Резултатите показаха, че тези клетки показват различни характеристики на растеж. По-конкретно, много повече LTβR нулеви клетки от LTβR +/+ клетки показват увеличен клетъчен обем (вертикална ос) и намалена дебелина на клетъчната мембрана (хоризонтална ос) (Фигура 4 А, клетки между червените линии). Фигура 4 B показва 3D структурите на наблюдаваните живи LTβR +/+ клетки (Фигура 4 B, вляво) и LTβR -/- клетки (Фигура 4 B, вдясно). Ясно е, че LTβR -/- клетките с бял цвят са апоптотични, тъй като потокът от течности през апоптотичните клетъчни мембрани (неизправност в пропускливостта) води до увеличен обем на клетките и следователно изсветлените клетъчни мембрани отразяват различни цветове.

Ефектът на LTβR върху апоптозата на IPEC-J2. LTβR +/+ и LTβR -/- клетки се посяват в 6-ямкови плаки и апоптозата се проследява в продължение на 72 часа чрез HoloMonitor®M4 микроскопия. (A) Точкови график на LTβR +/+ и LTβR -/- IPEC-J2 клетки след 72 h култура. Оста x е средната дебелина (µM) на клетките, а оста y представлява повърхността на клетките (µM2). Апоптотичните клетки с по-малка дебелина и по-голяма повърхност са между червените линии. Забележете, че почти няма апоптотични клетки между червените линии за групата LTβR +/+ (вляво), докато значително повече апоптотични клетки се намират в LTβR -/- клетъчната популация (вдясно). (Б.) Триизмерни структури на живи LTβR +/+ (вляво) и LTβR -/- (вдясно) клетки след 72 часа. Броят на високите клетки значително се увеличава в LTβR -/- клетките. (° С) PCR данни в реално време на член на TNF от суперсемейство 10 (TNFSF10) и Caspase 3 (CASP3) в LTβR +/+ и LTβR -/- клетки, * p -/- клетки (Фигура 4 В).

3.5. LTβR нокаут IPEC-J2 клетки са податливи на PEDV

В обобщение, това проучване изследва ефекта на LTβR върху пролиферацията и апоптозата на IPEC-J2, както и неговата роля за PEDV инфекцията. Липсата на LTβR повишава чувствителността към PEDV инфекция в IPEC-J2 клетки, което може да бъде причинено от значително потиснати NFκB целеви гени (IL-6 и IL-8) и свързани с целостта на лигавицата бариери гени (VCAM1 и IL-22). Нашият in vitro клетъчен модел ще бъде полезен за по-доброто разбиране на биологичната функция на LTβR и клетъчните реакции на PEDV инфекцията.

Популярен

Те четат сега