ЛАБОРАТОРИЯ

Комплекти за бърз тест за скрининг на месо и птиче месо
За разлика от традиционните микробни методи за откриване на хранителни бактерии, които използват растеж в хранителни среди, изолиране и биохимична идентификация, комплектите за бързо тестване са създадени, за да направят откриването и идентифицирането на микроорганизмите по-бързо, по-удобно, по-чувствително и по-специфично.

тест

Някои комплекти за бърз тест използват биохимични техники за откриване, но много от тях вече са тестове, базирани на антитела и ДНК. С малки изключения, почти всички анализи, използвани за откриване на специфични патогени в храните, изискват известен растеж в обогатителна среда преди анализ. Повечето от тези комплекти се състоят от устройство за еднократна употреба, съдържащо среда или субстрати, специално проектирани да идентифицират бактериална група или вид. С изключение на няколко комплекта, при които резултатите могат да бъдат прочетени за 4 часа, повечето изискват инкубация за 18–24 часа.

Според Администрацията по храните и лекарствата, ДНК-базирани аналитични формати за откриване на хранителни патогени използват сонди, полимеразна верижна реакция (PCR) и бактериофаги. Сондните анализи насочват рибозомната РНК (rRNA), тъй като по-голямото количество бактериална rRNA осигурява усилена мишена и дава по-голяма чувствителност на анализа. PCR анализът използва къси фрагменти от ДНК или праймери, които се хибридизират до определена последователност, която след това се амплифицира ензимно с помощта на термоциклер. PCR може да усили едно копие на ДНК милион пъти за няколко часа, намалявайки необходимостта от културно обогатяване. Въпреки това, инхибиторите в хранителни проби могат да предотвратят свързването на праймера и да намалят ефективността на усилване, така че изключителната чувствителност, постижима чрез PCR с чисти култури, често се намалява при тестване на храни. Следователно все още е необходимо културно обогатяване преди анализа. Взаимодействието на фаг с неговия бактериален гостоприемник също се използва за разработване на тестове за хранителни патогени.

Друга група бързи тестове се основават на свързването на антитялото с антигена. Според FDA те представляват най-голямата група бързи методи, използвани при тестване на храни. Различни формати се използват в анализите на антитела, включително латекс аглутинация; модификация на латекс аглутинация, известна като обратна пасивна латекс аглутинация; имунодифузия; ензимно-свързаният имуносорбентен анализ (ELISA); и технология за имуномагнитно разделяне (IMS).

ELISA е най-разпространеният формат за анализ на антитела, използван за откриване на патогени в храните. В този формат, обикновено проектиран като „сандвич“ анализ, антитяло, свързано с твърда матрица, се използва за улавяне на антигена от обогатяващи култури, а за откриване се използва второ антитяло, конюгирано с ензим. Стените на кладенци в микротитърни плочи са най-често използваната твърда опора; но ELISA също са проектирани с помощта на пръчки, гребла, мембрани, върхове на пипети или други твърди матрици.

В IMS антитела, свързани с магнитни частици или мъниста, се използват за улавяне на патогени от среда за предварително обогатяване. IMS е аналог на селективното обогатяване, но вместо да се използват антибиотици или сурови реагенти, които могат да причинят стрес, се използва антитяло за улавяне на антигена - много по-мека алтернатива. Уловените антигени могат да бъдат посяти или допълнително тествани с помощта на други анализи.

Имунопреципитацията или имунохроматографията е друг анализ, базиран на антитела, който се основава на технологията, разработена за домашни тестове за бременност. Това също е „сандвич” процедура, но вместо ензимни конюгати, антитялото за откриване се свързва с цветни латексови топчета или с колоидно злато. Използвайки само аликвотна част от 0,1 ml, пробата за обогатяване се променя през серия камери, за да се получат резултати. Тези анализи са изключително прости, не изискват измиване или манипулация и се извършват в рамките на 10 минути след културно обогатяване.

Освен тестовете, базирани на ДНК и антитела, има и множество други анализи, вариращи от специализирани среди до прости модификации на конвенционалните анализи, които водят до спестяване на труд, време и материали. Някои, например, използват картони за еднократна употреба, съдържащи дехидратирана среда, което елиминира нуждата от плочи от агар, което представлява икономия при съхранение, инкубация и процедури за изхвърляне. Други включват в средата специализирани хромогенни и флуорогенни субстрати за бързо откриване на ензимната активност на белезите. Съществуват и тестове, които измерват бактериален аденозин трифосфат (АТФ), който (макар и да не идентифицира конкретни видове), може да се използва за бързо изброяване на наличието на общи бактерии.

Регулаторни проблеми
През 2000 г. Службата за безопасност и инспекция на храните в САЩ (FSIS) завърши прилагането на своето правило за системите за намаляване на патогена/анализ на опасностите и критичните контролни точки (HACCP), което беше публикувано в Федерален регистър от 25 юли 1996 г. Съгласно регламентите, всяко месо и птиче растение трябва да разработи и изпълни писмен план за изпълнение на своите санитарни отговорности и да разработи и приложи HACCP план, който систематично да разглежда всички значителни опасности, свързани с неговите продукти. Освен това всички кланици трябва редовно да тестват за генерични продукти Ешерихия коли да проверят техните процедури за предотвратяване и намаляване на фекалното замърсяване. Суровите продукти от кланици и растения, които смилат месо и птици, са обект на Салмонела тестване от FSIS. Тези усилия са насочени към намаляване на микробното замърсяване с течение на времето.

През ноември 2002 г. FSIS прилага директива за намаляване Listeria monocytogenes в готови за консумация продукти от месо и птици. Директивата включва инструкции за стъпките за вземане на проби и проверка на FSIS, за да се гарантира, че плановете на HACCP на централата и санитарните стандартни оперативни процедури (SSOP) ефективно контролират наличието на L. monocytogenes в готови за консумация продукти. FSIS започна да тества готови за консумация продукти L. monocytogenes през 1987 г., защото това е единственият щам на Листерия което постоянно се свързва с човешко заболяване. В същото време FSIS също така измени сегменти от своята програма за микробиологично тестване за Е. coli O157: H7. Раздели на директива на FSIS, освобождаващи някои кланици от произволни FSIS Е. coli O157: Тестването на H7 ще бъде премахнато. Всички смлени телешки растения ще станат част от програмата за тестване на случайни проверки на FSIS.

Приложения и аванси
Комплектите за бързо тестване са предназначени за използване с програми за контрол на качеството за скрининг на много проби от храна за наличие на определен патоген или токсин. Според FDA обаче Бактериологичен аналитичен наръчник (www.cfsan.fda.gov/

ebam/bam-toc.html), положителен резултат от бърз метод се счита само за предполагаем и трябва да бъде потвърден със стандартни методи. Потвърждението на положителния резултат може да удължи анализа с няколко дни. Скрининговият тест показва дали пробата е потенциално положителна за патоген. Ако пробата е отрицателна, не се прави допълнителен анализ. Ако скрининговият тест показва потенциален положителен резултат, се провеждат допълнителни тестове, за да се потвърдят резултатите от скрининга.

Най-бързите методи могат да бъдат направени за няколко минути до няколко часа, така че те са по-бързи от традиционните методи. Но при анализа на храните бързите методи все още нямат достатъчна чувствителност и специфичност за директно тестване, така че храните все още трябва да бъдат обогатени с култура преди анализ. Въпреки че обогатяването е ограничение по отношение на скоростта на теста, то осигурява съществени ползи, като разреждане на ефектите на инхибиторите, позволяване на диференциацията на жизнеспособни от нежизнеспособни клетки и позволява възстановяване на клетъчен стрес или нараняване, което може да е довело по време на хранене обработка.

Няколко компании предлагат нови продукти в зоната за тестване на месо и птици.

• BioControl, Bellevue, Вашингтон, представи системата EHEC8 ™, ново обогатяване за Е. coli O157: H7, който според компанията намалява общото време за тестване на сурово говеждо месо от 24 часа на по-малко от 9 часа. Новото обогатяване е разработено, за да помогне на преработвателите на говеждо месо да изпълнят новата директива на FSIS по отношение Е. coli O157: H7 замърсяване на продукти от говеждо месо. Новата среда е значителен напредък, тъй като съкращава времето за обогатяване от 16–24 часа, изисквано от други методи, до по-малко от 9 часа. Това позволява продуктът да бъде пуснат до два дни по-рано.

Системата включва еднократно 8-часово обогатяване, като се използва патентована среда EHEC8 на BioControl, или VIP® за EHEC тест, или Assurance® EHEC EIA. В допълнение към извеждането на продукта на пазара по-бързо, системата EHEC8 е официален метод на AOAC за откриване на Е. coli O157: H7 в сурово и варено говеждо месо. Компанията казва, че системата EHEC8 е била широко тествана и валидирана от независими лаборатории по време на съвместно проучване, проведено сред 30 лаборатории, представляващи правителството, както и частната индустрия в САЩ и Канада. Резултатите демонстрират, че средата EHEC8, използвана или с VIP за EHEC, или с Assurance EHEC EIA, е еквивалентна на процедурата за референтна култура USDA/BAM.

Системата EHEC8 за сурово или варено говеждо месо е бърза, гъвкава система, която увеличава производителността с еднократното си обогатяване и краткото време за изпълнение. Системата е пълна и не са необходими скъпи антибиотици или добавки, което я прави много рентабилна.

• Neogen Corp., Лансинг, Мичиган, предлага своя Gene-Trak Listeria monocytogenes Анализ. Тестът за ДНК хибридизация използва L. monocytogenes- специфични ДНК сонди и колориметрична система за откриване за откриване на този вид в проби от храни и околна среда след обогатяване на култура от бульон. Пробата се счита за отрицателна за наличие на L. monocytogenes ако получената стойност на абсорбция е по-малка или равна на установената гранична стойност за анализа. Пробата се счита за предполагаемо положителна, ако получената стойност на абсорбция е по-голяма от установената гранична стойност на анализа.

Neogen предлага и тест Reveal® за Е. coli O157: H7. Казва се, че тестът позволява скрининг на проби за този патоген след 8 часа обогатяване на пробата. За да се извърши тестът, 120 ml порция от обогатителната култура се поставя в кръглия отвор за проби на тестовото устройство и се извежда през реагентна зона, която съдържа специфични антитела (анти-Е. coli O157: H7), конюгиран с колоидни златни частици. Ако в пробата присъстват антигени, те ще се свържат със конюгираните със злато антитела. След това този комплекс антиген-антитяло напуска зоната на реагента и преминава през нитроцелулозната мембрана, която съдържа зона на анти-Е. coli O157: H7 антитяло. Имунният комплекс със златен конюгат се улавя и се агрегира в тази зона, като по този начин показва видима линия. Това е официален метод на AOAC, използван от FSIS.

Qualicon Div. на DuPont, Уилмингтън, Дел., предлага системата BAX® за скрининг на готови за консумация продукти L. monocytogenes. Скрининговият тест използва PCR за амплифициране на ДНК. Ако в проба присъства патоген, системата копира ДНК на патогена, произвеждайки достатъчно ДНК, която да бъде открита. Ако се получи усилване, пробата се анализира допълнително. Ако не се получи усилване, не се извършват допълнителни тестове върху пробата. Като част от текущия си процес на оценка на процедурите за съкращаване на времето, необходимо за получаване на резултатите от теста, като същевременно се поддържа аналитично качество, FSIS прие този тест през април 2002 г. за скрининг на проби от месо и птици за L. monocytogenes. Агенцията планира да оцени системата за Салмонела и Е. coli O157: H7 за използване във всичките три негови лаборатории за полеви услуги.

Следващото поколение
Според FDA, поради сложните формати на бързите тестове и трудностите при тестването на храни, потребителите трябва да внимават при избора на бързи методи и да оценяват внимателно тези тестове. Технологията продължава да напредва и следващото поколение анализи, като биосензори и ДНК чипове, които потенциално имат способността за почти реално време и онлайн наблюдение на множество патогени в храните, вече се разработват.

Джеймс Гиез
Интернет редактор