Подобни теми на научна статия по биологични науки, автор на научна статия - P. L. C. Lefevre, R. G. Berger, S. R. Ernest, D. W. Gaertner, D. F. K. Rawn, et al.

Академичен изследователски труд на тема „Излагане на женски плъхове на екологично подходяща смес от бромирани забавители на горенето е насочена към яйчниците, засягащи фоликулогенезата и стероидогенезата“

БИОЛОГИЯ НА РАЗМНОЖЕНИЕТО (2016) 94 (1): 9, 1-11 Публикувано онлайн преди печат на 25 ноември 2015 г. DOI 10.1095/biolreprod.115.134452

излагане

Излагането на женски плъхове на екологично подходяща смес от бромирани забавители на горенето е насочено към яйчниците, засягащи фоликулогенезата и стероидогенезата1

Pavine L.C. Lefevre, 3 Robert G. Berger, 3 Sheila R. Ernest, 3 Dean W. Gaertner, 5 Dorothea F.K. Rawn, 5 Michael G. Wade, 6 Bernard Robaire, 3,4 и Barbara F. Hales2,3

3D отдел по фармакология и терапия, Университет Макгил, Монреал, Квебек, Канада

4 Катедра по акушерство и гинекология, Университет Макгил, Монреал, Квебек, Канада

5 Отдел за изследвания на храните, Бюро по химическа безопасност, здравеопазване и хранителни продукти, здравеопазване, Канада, Отава,

6 Бюро за наука и изследвания в областта на околната среда, Дирекция по радиация и изследвания, Health Canada, Отава, Онтарио, Канада

1Поддържа се с грант RHF100625 от Канадския институт за здравни изследвания (CIHR) Институт за човешко развитие, здраве на децата и младежта. R.G.B. е получател на награда NSERC Create от Reseau Quebecois en Reproduction и PLCL на стипендия Fonds de recherche du Quebec-Sante. B.R. и B.F.H. са професорите на Джеймс Макгил. Центърът за изследвания и анализ на лигандите на репродуктивния лиганд към Университета на Вирджиния се поддържа от безвъзмездната помощ на Eunice Kennedy Shriver NICHD/NIH (SCCPIR) U54-HD28934. Кореспонденция: Барбара Ф. Хейлс, Катедра по фармакология и терапия, Университет Макгил, 3655 Promenade сър Уилям Ослер, Монреал, QC, H3G 1Y6, Канада. Имейл: [email protected]

Получено: 12 август 2015 г. Първо решение: 28 септември 2015 г. Прието: 13 ноември 2015 г.

elSSN: 1529-7268 http://www.biolreprod.org ISSN: 0006-3363

андрогени, бромирани забавители на горенето, каталаза, ендокринни разрушители, фоликулогенеза, HBCDD, инсулиноподобен фактор 3, яйчници, оксидативен стрес, PBDE, стероидогенеза, токсикология

Огнезащитните химикали се произвеждат в големи количества, широко разпространени в околната среда и се откриват във всеки от нас и се биоакумулират [1]. Тези химикали са включени в множество продукти, които обикновено са лесно запалими, като пластмаса, текстил и пяна; те допринасят до 30% от теглото на компонентите в офис и битова електроника, синтетични строителни материали и мебели или моторни превозни средства [1]. Основен клас забавители на горенето са представени от бромирани забавители на горенето (BFR), включително полибромирани дифенилови етери (PBDEs) и хексабромоциклододекан (HBCDD) [1]. С течение на времето тези забавители на горенето излизат в битова среда, което води до повтаряща се експозиция чрез вдишване и поглъщане [2, 3]. Тъй като BFR са липофилни и постоянни [4], те се биоакумулират в кърмата, серума и мастните тъкани на човека [5] и се биомагнифицират чрез хранителни вериги [3]. Редица PBDEs, забранени в Северна Америка повече от 10 години, все още се откриват в човешките телесни течности, както и в битовия прах [6, 7].

Увеличават се доказателствата, че BFR са ендокринни разрушители, засягащи андрогенни, естрогенни и тиреоидни хормонални дейности [8]. При хората неблагоприятните ефекти върху репродукцията на мъжете са свързани с излагане на BFR и включват промени в нивата на стероидни хормони [9-11] и намаляване на броя и качеството на сперматозоидите [12-14]. Вътреутробната и лактационна експозиция на PBDEs е свързана с повишена честота на крипторхизъм [15, 16]. При подрастващите момичета високите серумни нива на BFR се свързват с по-ранна възраст на менархе [17-19]. Предишни проучвания съобщават, че откриването на високи нива на PBDE във фоликуларна течност или в серум е свързано с по-дълго време за зачеване [20] и с неуспех на имплантирането на ембриона след ин витро оплождане [21].

Повечето проучвания за ефектите на BFR при животински модели се фокусират върху последиците от излагането на отделни конгенери или търговски смеси. Тези проучвания показват, че BFR нарушават ендокринната система [8, 22] и са свързани с диабет, рак и невроповеденчески нарушения и нарушения на развитието [23]. Прозорецът на експозиция е важен, тъй като перинаталното излагане на BFRs води до явни смущения във времето на пубертета и гаметогенезата при мъжки и женски плъхове

[24-27]. Една от трудностите при свързването на експериментите върху животни с човешкото здраве е, че излагането на човека е на сложните смеси от BFR, открити в околната среда, а не на специфични, отделни конгенери. Ние показахме, че хроничното излагане на възрастни мъжки плъхове на подходяща за околната среда BFR смес, имитирайки относителните нива на конгенера в домашния прах, води до увеличаване на черния дроб и бъбреците и промяна на параметрите на тиреоидния хормон при липса на ефекти върху репродуктивната система [ 28]. Не се наблюдават промени в естрозната цикличност или резултатите от бременността, като индекси на чифтосване и плодовитост или брой живи плодове, при женски плъхове, хранени със същата BFR смес преди чифтосване и по време на бременността [29]. Въпреки това, in vitro проучвания с фоликули от свински антрали показват, че производството на стероидни хормони и експресията на стероидогенни ензими се влияят от единични PBDE конгенери [30], техните метаболити [31] или смес, отразяваща PBDEs, открити в човешки серум [32].

Може да има множество обяснения за различия в констатациите в епидемиологични проучвания, in vivo опити с животни и in vitro проучвания. Една от възможностите е, че съществуват видови различия; BFR обаче имат сходни ендокринни разстройства при широк спектър от видове [8]. Втората възможност е, че стандартните процедури за тестване за оценка на въздействието на такива химикали върху женската репродукция може да не открият важни ефекти върху функцията на яйчниците. Целта на настоящото проучване е да се определи дали BFRs са насочени към яйчника при плъхове. За постигане на тази цел бе оценена функцията на яйчниците при женски плъхове Sprague-Dawley, хранени с подходяща за околната среда BFR смес преди чифтосване и по време на бременността, при които не са наблюдавани значителни промени в естросната цикличност, чифтосване или плодовитост [29].

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Формулировка на BFR смес

Формулирането на BFR смес е описано по-рано [28, 29]. Накратко, три технически PBDE смеси (DE-71, DE-79 и BDE-209) и една HBCDD смес бяха комбинирани, за да се получи съотношение на PBDE конгенери и HBCDDs, сравними със средните нива, наблюдавани в домакинския прах в Бостън [33]. Тази BFR смес е включена в диета без изофлавон (Teklad Global 2019; Harlan Laboratories). Диетите бяха формулирани да съдържат 0, 0.75, 250 или 750 mg BFR смес на килограм. Събрани са диетични проби от всяко експериментално състояние и съдържанието на BFR е потвърдено чрез газова хроматография/масспектрометрия, както е описано по-рано [34]. Тези диети, допълнени с BFR, са проектирани да доставят номинални дози от 0, 0,06, 20 и 60 mg/kg телесно тегло/ден, като се приема дневна консумация на храна от 80 g/kg телесно тегло/ден. Оценява се, че най-ниската доза е приблизително приближение на максималната експозиция на човека въз основа на скоростта на поглъщане на прах от 100 mg/ден при деца (16,5 kg телесно тегло) и мащабирането на дозата от хора към гризачи (съотношение на телесната площ от човек към плъх, 1: 6.3) [33, 35].

Животни и лечение

Девствени женски плъхове Sprague-Dawley (тегло, 200-250 g) са получени от лабораториите на Charles River. Животните бяха настанени поотделно в Центъра за животински ресурси на университета Макгил в помещения, поддържани при 20 ° C на 12L: 12D фотопериод. Храната и водата бяха осигурени по желание. Всички проучвания върху животни са проведени в съответствие с процедурите и принципите, описани в Ръководството за грижа и използване на експериментални животни, изготвено от Канадския съвет по грижа за животните по протокол 4456. След 1 седмица аклиматизация към контролната диета, женските плъхове бяха произволно назначен на едно от четирите експериментални условия (n = 35-38 на група) и хранен с добавка към BFR за 2-4 седмици преди чифтосване. През този период естросната цикличност се оценява чрез анализ на вагиналната цитология [36]. Женските в проеструса са поставени в клетка с доказани разплодни мъжки плъхове Sprague-Dawley (поддържани на контролна диета) за една нощ. Гестационен ден (GD) 0 е определен като деня, в който е наблюдавана сперматозоидна позитивна вагинална цитонамазка. След осеменяването женските продължават да спазват съответните си диети до евтаназия на GD 20.

Язовирите бяха евтаназирани чрез задушаване на CO2, последвано от обезкървяване чрез сърдечна пункция на GD 20. Яйчниците бяха отстранени и претеглени. Десният яйчник се фиксира в 4% параформалдехид, докато левият се съхранява при -80 ° С за анализ на генната експресия. Цялата кръв се прехвърля в Vacutainer SST (BD Biosciences), оставя се да се съсирва за 30 минути при стайна температура, след това се държи на лед за не повече от 4 часа до центрофугиране при 1300 X g за 20 минути. Серумът се разделя на аликвотни части и се съхранява при -80 ° C.

Измервания на BFR серумни нива

1 g) се размразяват и претеглят в 50 ml стъклени епруветки за центрофуга. Всяка проба беше подсилена със заместващи стандарти (дванадесет маркирани с 13C12 PBDE конгенери [BDE-15, BDE-28, BDE-47, BDE-77, BDE-99, BDE-100, BDE-126, BDE-138, BDE-153, BDE-154, BDE-183 и BDE-209; Кеймбриджски изотопни лаборатории] и 13C12 с етикет a-, b- и y-HBCDD; Wellington Laboratories). Пробите се хомогенизират и екстрактите се почистват, както е описано по-горе [34]. След елуирането на PBDE от дезактивираните колони Florisil (60-100 меша; Fisher Scientific) със 70 ml хексан, втора колба с кръгло дъно се поставя под колоната Florisil и изомерите на HBCDD се елуират с помощта на 70 ml дихлорометан: хексан (30:70, v/v). И двете фракции се намаляват в обем до приблизително 1 ml, използвайки ротационно изпаряване. Фракцията PBDE се прехвърля във флакон с v-образен изрез, изпарява се до сухо, като се използва лек поток от азот, преразрежда се в изо-октан и се смесва. Крайният изо-октанов екстракт се прехвърля в хроматографски флакон за анализ. Фракцията HBCDD беше прехвърлена по подобен начин във флакон с v-образен изрез, но взета само до почти сухо (

50 il) използване на лек поток от азот преди добавянето на аналози на C122H18Br6 на a-, b- и y-HBCDD като стандарти за ефективност. След това пробите се поставят в димния аспиратор, където остават до достигане на сухота. Към всеки сух екстракт от HBCDD се добавят 100 il метанол: вода (80:20, v/v) и флаконът се смесва и се прехвърля във флакон за хроматография. Разреждането на екстракти от серумни проби е необходимо за плъхове, които са били хранени с високи концентрации на PBDE и HBCDD (напр. 20 и 60 mg/kg/ден), за да се гарантира, че могат да се постигнат точни измервания на концентрацията. Анализът и осигуряването на качеството бяха извършени, както беше описано по-горе [29, 34].

Фоликулни морфометрични анализи

Диаметрите и площите на фоликулите на всички етапи, както и ширините на гранулозните и тека-клетъчните слоеве в антралните фоликули, бяха измерени в 3-10 фоликула на етап на яйчник и в пет яйчника на експериментална група с помощта на софтуера ImageJ [38] . Диаметрите се измерват последователно в участъци с видим ооцит и се записват като най-голямото разстояние по права линия между противоположните ръбове на фоликула, което преминава през ооцита. Измерванията на площ включват тека клетъчния слой. Определянето на дебелината на гранулозата и тека на отделението се извършва по същите критерии като тези, прилагани за измерване на диаметъра.

Локализация на протеини чрез имунохистохимия

Количествено определяне на нивата на серумен хормон

Стероидните хормони, включително прегненолон, прогестерон, 17-ОН прегнен-олон, 17-ОН прогестерон, дихидроепиандростерон, андростендион, тестостерон и дихидротестостерон (DHT), бяха измерени в серийни проби от 100 ила чрез течна хроматография с двойна масова спектрометрия (управлявана от компанията OpAns LLC) с помощта на капилярна високоефективна система за течна хроматография Agilent 1200, свързана с Agilent Triple Quad LC/MS (модел 6430). Серумните нива на фоликулостимулиращ хормон (FSH) и лутеинизиращ хормон (LH) са измерени на платформата Luminex 2000IS с помощта на панела на хипофизата Milliplex на плъхове (Millipore) и естрадиол чрез радиоимуноанализ (Siemens Medical Solutions Diagnostics) в лабораторията за анализ и анализ на лигандите. (Център за изследване на репродукцията, Университет на Вирджиния). Комплекти ELISA за анти-мюлеров хормон на плъхове (AMH) (Cusabio Life Sciences) са използвани за количествено определяне на серумните нива на AMH. Количественото определяне на нивата на хормони и гонадотропин беше направено в 16-21 серумни проби на експериментална група.

Количествено определяне на протеини от Western Blots

Количествено определяне на генната експресия

Цялостната екстракция на РНК от 30 mg яйчникова тъкан е направена с помощта на RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) в съответствие с препоръките на производителя-

Статистическите анализи бяха направени с помощта на софтуер SigmaPlot (софтуер Systat). Данните бяха анализирани чрез еднопосочен ANOVA, последван от post hoc тест на Holm-Sidak, за да се сравнят средните стойности на параметрите, измерени при третирани спрямо контролни животни. Когато тестовете за допускания за хомогенност на дисперсията и нормалността се провалиха, данните бяха преобразувани и повторно тествани. Когато хомоскедастичността и нормалността все още не са били удовлетворени след тази трансформация, данните са тествани повторно с помощта на Kruskal-Wallis ANOVA в редици. За статистически анализ на броя на фоликулите първичните и вторичните фоликули бяха комбинирани и категоризирани като преантрални фоликули. Броят на фоликулите се анализира с помощта на коефициента на Пиърсън. Нивото на значимост е определено на P