Субекти

Резюме

Въведение

Затлъстяването в световен мащаб се е удвоило от 80-те години на миналия век (Finucane et al, 2011). Въпреки че има няколко причини за това, преобладаващата хипотеза е, че повишената наличност на евтини, лесно достъпни и силно вкусни храни води до преяждане. Преяждането е най-големият определящ фактор за затлъстяването (Swinburn et al, 2009), но ние разбираме много малко от нервните механизми, в основата на които хората продължават да консумират храна, независимо от ситостта. Мотивационната стойност на хранителните везни със състояние на глад. Например стимулиращата стойност на храната е по-ниска по време на ситост, но се засилва, когато човек е гладен или е изложен на различни вкусни хранителни възможности (Berridge, 1991; Rolls et al, 1988; Stoeckel et al, 2007). За разлика от това, хората със затлъстяване не са чувствителни към промените в мотивационната стойност на храната и продължават да се хранят по навик, дори ако храната е била обезценена със ситост (Horstmann et al, 2015). По същия начин гризачите на диета в кафенето продължават да консумират храна, когато мотивационната стойност на храната е обезценена със ситост (Reichelt et al, 2014) или от наличието на отвратителни сигнали (Johnson and Kenny, 2010).

Орбитофронталната кора (OFC) е замесена в оценката на наградите и вземането на решения. OFC невроните съдържат информация, базирана на стойността, „онлайн“, за да насочва вземането на бъдещи решения и по този начин да изчислява вероятността от конкретни резултати да насочват бъдещите отговори (Wilson et al, 2014). Като се има предвид, че OFC получава значителна сензорна информация и съдържа неврони, които реагират на вкус и обоняние (Rolls, 2012), OFC вероятно интегрира сигнали за сензорните свойства на храната (вкус, текстура, мирис) с очаквани резултати. OFC лезиите или инактивирането са свързани с увреждане или при индуциране на ситост (Gremel and Costa, 2013; Rudebeck et al, 2013) или при LiCl (болест), девалвация на храната (Schoenbaum et al, 2003). По този начин OFC регистрира текущата стойност на храните и актуализира действията въз основа на тази информация. Тъй като хората със затлъстяване и плъхове, хранени с диета в кафенето, са нарушили обезценяването на хранителните награди, дисфункцията в OFC може да бъде замесена като потенциален двигател на преяждането.

За да изследваме ефектите на затлъстяването върху функцията на OFC, използвахме обезогенен модел, описан по-рано в (Johnson and Kenny, 2010). На три групи беше даден диференциален достъп (0, 1 или 24 часа) до диета „в стил кафене“, състояща се от вкусна, енергийно гъста храна, лесно достъпна за консумация от човека, в допълнение към ad libitum достъп до чау в продължение на 40 дни. Ограниченият 1-часов достъп осигурява важно сравнение, тъй като може да се разграничат ефектите поради затлъстяването, тъй като предишни доклади показват, че ограниченият достъп до диета в кафенето не е обезогенен (Johnson and Kenny, 2010). Ние предположихме, че индуцираното от диетата затлъстяване поради разширения достъп до диета в кафенето променя структурата и функцията на пирамидалните неврони на OFC.

Материали и методи

Субекти

Мъжки плъхове Long-Evans (Charles River Laboratories, Квебек, Канада) са получени приблизително след раждането 60-ия ден (285-325 g в началото на всички експерименти). Плъховете бяха настанени индивидуално на 12:12 цикъл на обратната светлина тъмно (светлините светват в 8:00 сутринта). Плъховете бяха разрешени ad libitum достъп до стандартна чау (5P14 LabDiet, Сейнт Луис, Мисури) и вода за времето на експеримента. Всички експериментални процедури бяха одобрени от Комитета за грижа за животните към Университета в Калгари съгласно насоките на Канадския съвет за грижа за животните.

Кафетерия Диета

Всички плъхове бяха настанени индивидуално върху хартиени постелки (Alphapads, Lawrenceville, GA), за да се предотврати замърсяването на храните с разхлабени материали за постелки. Диетата в кафенето се състоеше от говеждо месо от говеждо месо от Kirkland, Froot Loops, дупки за понички Timbit, крафт фъстъчено масло и Doritos. Цялата храна се претегля след завършване на храненето и се коригира за дехидратация. Калорийният прием от различните макронутриенти се изчислява, като се използва хранителната информация, предоставена от производителя (допълнителна таблица 1). Плъховете са били изложени на диета в кафенето в продължение на 1 h на ден (ограничен достъп), 23 h на ден (разширен достъп) или 0 h на ден (само чау) в продължение на минимум 40 дни. Храната се попълваше ежедневно 2 часа в техния тъмен цикъл. Експозицията от 1 h за плъхове с ограничен достъп беше представена между 2-3 часа в техния тъмен цикъл. Тъй като всеки тип храна има различна калорийна плътност (допълнителна таблица 1), общата консумация се измерва в обобщени kCal за всеки вид храна вместо общите консумирани грамове.

Индуцирано от реплика потискане на поведението при хранене

Процедурите за хранене се провеждат в звукови атенюирани оперантни камери (Med Associates, Burlington, VT). Храните се поставяха в малки съдове с фолио. Всички храни се претеглят преди и след хранене, които се провеждат по време на тъмния цикъл. На плъховете беше разрешен достъп от 30 минути на ден до диетата в кафенето (или чау в плъхове само с чау) в продължение на 5 дни, за да се постигне стабилен прием на храна през изходния период и след това се върнаха в домашните клетки, съдържащи само чау. Изходният прием се записва като осреднената kcal/сесия през последните 3 дни. След това плъховете бяха подложени на четири сесии за кондициониране в последователни дни в същата оперантна камера. По време на 30-минутни сесии за кондициониране, светлината-сигнал се активира за 10 минути, изключва се за 10 минути и след това се включва отново за 10 минути. Наказаните плъхове са получили шок на крака само по време на представяне на светлината на репликата (0,5 mA за 1,0 s; 10 стимулации с

1 мин интервали). По време на тези сесии в камерите не присъства храна. В деня след последната сесия за кондициониране, плъховете първоначално са били изложени на 5-минутен напомнящ крак с напомняне на светлина. Плъховете бяха извадени от камерата, след това заменени и изложени на светлината-реплика при липса на удар на крака в продължение на 30 минути сесия със светлина, активирана периодично (10 минути на разстояние, 10 минути на разстояние, 10 минути нататък) в присъствието на кафенето диета или чау за плъхове само за чау. В отделен експеримент плъховете са били обучавани еднакво, с изключение на това, че не са били изложени на удара на крака. Само животни от чау са получавали чау в изходните и тестовите дни.

Подготовка на филийки

В деня след теста за условна супресия плъховете се упояват с изофлуран обезглавен и короналните срезове, съдържащи страничния OFC, се изрязват на 300 μm върху вибратом (Leica, Nussloch, Германия) в разтвор, съдържащ (в mM): 75 захароза, 87 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 7MgCl2, 0.95 CaCl2 и 3 кинуренова киселина. Коронарните срезове веднага се прехвърлят в 250 ml aCSF, съдържащ (в mM) 126 NaCl, 1,6 KCl, 1,1 NaH2PO4, 1,4 MgCl2, 26 NaHCO3, 11 глюкоза, 2,4 CaCl2 и се инкубират за минимум 60 минути при 31,4–33 ° C преди до запис. Всички разтвори са непрекъснато наситени с 95% O2/5% CO2.

Електрофизиология

AMPAR спонтанните EPSC (sEPSCs) са регистрирани в напрежение на клетките, притиснати при –70 mV в пикротоксин (50 μM) и APV (50 μM). Спонтанните IPSCs (sIPSCs) бяха записани в напрежение на клетките, затегнато при +10 mV в DNQX (10 μM), стрихнин (1 μM) и DPCPX (1 μM), APV (50 μM). Миниатюрни EPSC (mEPSC) бяха записани при -70 mV, а миниатюрни IPSC (mIPSCs) бяха записани при +10 mV в присъствието на тетродотоксин (500 nM), за да блокират спонтанни събития, предизвикани от потенциал за действие. AMPAR mEPSCs бяха избрани въз основа на тяхната амплитуда (> 12 pA), време на разпадане (12 pA), време на нарастване (TM комплект (FD Neurotechnologies). Импрегнираните блокове бяха нарязани в серийни коронални участъци с дебелина 200 μm с помощта на вибратом. Секции бяха събрани на желатинизирани предметни стъкла и монтирани с еднаква ориентация, подходяща за проследяване и реконструкция на дендрита. Секциите бяха изсушени на въздух (1 час), инкубирани в крайния разтвор за оцветяване, дехидратирани в градуирани алкохоли и монтирани. Импрегнирани с Golgi неврони, които бяха еднакво импрегнирани и повредени от хистологична обработка, бяха взети проби с ниска мощност. Пирамидалните неврони бяха идентифицирани чрез пирамидална сома и един изпъкнал аксон. Невроните бяха проследени с помощта на камера Lucida при 200X (21,17 μm/концентричен кръг) за разклоняване и 1000x (10 μM = 1 cm) за дендритни бодли.

Използван е анализ на Sholl, за да се характеризира морфологията на импрегнираните с Golgi пирамидални неврони. Идентифицирани са крайните краища както на базиларните, така и на апикалните дендритни дървета. Гръбнаците бяха преброени по последователни 10 μm фрагменти върху вторични дендрити, като се използва рамка в полето, която винаги започва 10 μm след разклоняване от първичния дендрит. За анализа са взети предвид само издатини, показващи непрекъснатост с дендритния вал. Всички анализи на плътността на гръбначния стълб и Sholl бяха заслепени за експерименталното състояние на животните.

Статистика

Стълбовидните графики представляват средна стойност ± s.e.m. N се отнася или за брой плъхове, или за брой неврони/плъх. Статистическата значимост се оценява с двупосочен ANOVA с тест за множествено сравнение на Dunnett, като се използват плъхове, хранени с чау, като контрола, освен ако не е посочено друго. Статистиката е представена в легендите за фигурите.

Резултати

Излагането на диета в кафенето може да предизвика затлъстяване (Johnson and Kenny, 2010; Rolls et al, 1980). Това вероятно се дължи на високото съдържание на мазнини и високото гликемично натоварване, съчетано с увеличеното разнообразие от достъпна храна (Rolls et al, 1983). За да потвърдим, че достъпът до диета в кафенето предизвиква затлъстяване, измервахме ежедневно наддаване на тегло за 40 дни. Плъховете с разширен достъп до диета в кафенето набираха значително повече тегло от плъховете с ограничен или никакъв достъп до диета в кафенето (Фигура 1а). До края на излагането на диета плъховете с ограничен или разширен достъп до диета в кафенето не се различават значително в консумацията на мазнини, въглехидрати или протеини (Фигура 1b), което предполага, че каквито и да са поведенчески или невронални различия не са задължително поради промени в хранителен състав.

индуцирана

След това тествахме дали има функционални последици от намалената морфология на базиларен гръбначен стълб и повишена базална сложност на страничните OFC пирамидални неврони на затлъстели плъхове. За да определим дали възбуждащите входове в пирамидалните неврони се променят чрез разширен достъп до диета в кафенето, ние записахме sEPSC (зависими и независими от потенциала на действие) и mEPSC (квантални) върху странични OFC пирамидални неврони. Достъпът до диета в кафенето не променя амплитудата или честотата на sEPSC, което предполага, че няма промяна в освобождаването на глутамат или неговите ефекти постсинаптично (Допълнителни 3A-C). По същия начин достъпът до диета в кафенето не променя амплитудата или честотата на mEPSC върху пирамидални неврони (Допълнителни 3D-E). За по-нататъшна оценка дали има промени в вероятността за освобождаване на глутамат, ние измерихме сдвоеното импулсно съотношение с интервал от 50 ms между стимулите, мярка, която надеждно корелира с вероятността за освобождаване (Thomson, 2000). Няма обаче съществена разлика между диетичните групи (допълнителни 3F, G). Взети заедно, нито пресинаптичното освобождаване на глутамат, нито броят или функцията на постсинаптичните AMPAR на пирамидални неврони не са променени при плъхове с удължен или ограничен достъп до диета в кафенето, което предполага, че тези ефекти не са функционална последица от намалената плътност на гръбначния стълб.

След това тествахме дали вътрешните свойства на страничните пирамидални неврони на страничен OFC на слой II/III се различават между плъхове с ограничен или разширен достъп до диета в кафене и плъхове, хранени с чау. В присъствието на възбуждащи и инхибиторни синаптични блокери, няма значителни разлики в предизвиканото от настоящия етап стрелба между захранващите групи (Фигура 4а и b). Освен това латентността на пиковете на OFC от пирамидални неврони от плъхове с удължен достъп (19 ± 2 ms) или ограничен достъп (19 ± 3 ms) до диета в кафенето не се различава от плъховете, хранени с чау (17 ± 3 ms; Фигура 4в) . Взети заедно, тези данни предполагат, че достъпът до диета в кафенето не променя присъщата възбудимост на пирамидалните неврони на OFC.

След това измерихме потенциала на мембраната в покой в ​​присъствието или отсъствието на синаптични блокери. При липса на синаптични блокери, мембранният потенциал в покой беше значително по-деполяризиран в страничните OFC неврони на плъхове с разширен достъп до диета в кафенето, в сравнение с плъхове с ограничен достъп или плъхове, хранени с чау (фигура 4г). Този ефект обаче липсва в присъствието на синаптични блокери (Фигура 4д). Взети заедно, тези данни предполагат, че страничните OFC неврони от плъхове с разширен достъп до диета в кафенето са по-деполяризирани поради промяна в синаптичния вход, но не и промяна в присъщата възбудимост.

Алтернативен механизъм за намален инхибиторен синаптичен вход към страничните OFC пирамидални неврони може да се дължи на намалена експресия на GABAergic интернейрони. Кортичните инхибиторни интернейрони, експресиращи парвалбумин (PV +), са регулатори на дейностите на локалната мрежа, така че активирането на PV + невроните може да синхронизира мрежите от пирамидални неврони в гама трептения (Buzsáki and Wang, 2012). Намалените кортикални PV + интернейрони са замесени в редица психични заболявания, които нарушават регулирането на префронталната обработка на информация (Coyle, 2004; Del Pino et al, 2013; Lewis et al, 2012; Volman et al, 2011). Следователно, ние преценихме дали достъпът до диета в кафенето е променил броя на PV + интернейроните в страничния OFC. Въпреки това, няма значителна разлика в броя на PV + невроните в страничния OFC на плъхове с удължен, ограничен или без достъп до диета в кафенето (допълнителни 4А, В). Взети заедно, докато разширеният достъп до диета в кафенето намалява освобождаването на GABA върху пирамидални неврони, това не се дължи на промяна в броя на PV + интернейроните.

Дискусия

Хиперфагията, задвижвана от наличието на вкусна храна с високо съдържание на мазнини и високо гликемично натоварване, е най-големият фактор, определящ затлъстяването (Gearhardt et al, 2011; Kelly et al, 2009; Popkin and Duffey, 2010). Хората често преяждат независимо от известните отвратителни последици. Дисфункцията на OFC е замесена в дезадаптивното вземане на решения (Wilson et al, 2014). Тук ние демонстрираме, че плъховете със затлъстяване имат променена базиларна плътност на гръбначния стълб и дендритно разклоняване, както и намалена вероятност за освобождаване на GABA върху слой II/III странични OFC пирамидални неврони. Тези животни също показват нарушения в гъвкавото поведение, така че да не потискат храненето в присъствието на отвратителни сигнали. Тези резултати сочат към потенциален механизъм, лежащ в основата на нехомеостатичното хранене.

Затлъстелите плъхове не възпрепятстват консумацията на храна при наличието на отвратителни сигнали

Плъхове с разширен достъп до диета на кафене са намалили вероятността за освобождаване на GABA върху пирамидални неврони на страничния OFC

Плъховете с разширен достъп до диета в кафенето имат променена структурна пластичност

Въпреки че плъховете с ограничен достъп не показват промени в възбудителното или инхибиторно синаптично предаване, има значително увеличение на плътността на гръбначния стълб във вентралния OFC. Смята се, че вентралният OFC преодолява медиалната и префронталната кортикална мрежа (Price, 2007), като гръбният стриатум е основната им екстракортикална цел (Hoover and Vertes, 2011). Докато плъховете с ограничен достъп служат като контрол на затлъстяването при излагане на диетата в тези проучвания, те показват нарушено хранително поведение, така че да консумират по-голямата част от ежедневната си енергийна нужда в рамките на един час. По този начин бъдещите проучвания могат да проверят дали вентралната проекция на OFC към стриатума участва в навик-подобен отговор, свързан с преяждане.

В заключение предлагаме нова хипотеза за това как затлъстяването може да повлияе на нехомеостатичното хранене. Ние демонстрираме, че плъховете със затлъстяване, които не потискат храненето в присъствието на отвратителни сигнали, са намалили вероятността от освобождаване на GABA върху OFC пирамидални неврони. Този ефект може да допринесе за повишена възбудимост на страничните OFC неврони поради по-деполяризирано състояние на покой. По този начин изходът от OFI неврони от слой II/III може да липсва подходящ синхрон за предаване на информация до техните целеви неврони. Тъй като OFC интегрира сензорна информация с настоящата стойност на наградата, за да насочва бъдещи действия, вероятно е причинената от затлъстяването дисфункция в OFC да накара хората да се хранят независимо от хомеостатичните нужди, което допълнително допринася за преяждането.

ФИНАНСИРАНЕ И РАЗКРИТИЕ

Тази работа беше подкрепена от FIN на CIHR: 148473, Фондация „Ум“ на Британския Колумбия за млад изследовател и Фонд „Бридж“ на Каминг по медицина към SLB. Авторите не декларират конфликт на интереси.