SRI HARMINDA PAHM HARTANTYO, MAN LING CHAU, TSE HSIEN KOH, MIN YAP, TSENG YI, DELPHINE YAN HONG CAO, RAMONA ALIKIITEAGA GUTIÉRREZ, LEE CHING NG; Хранителна Klebsiella pneumoniae: потенциал за вирулентност, устойчивост на антибиотици и рискове за безопасността на храните. J Food Prot 1 юли 2020 г .; 83 (7): 1096–1103. doi: https://doi.org/10.4315/JFP-19-520

klebsiella

Изтеглете файла с цитат:

В храната е открита мултирезистентна и потенциално вирулентна К. пневмония.

Хранителните проби не са носили хипервирулентна K. pneumoniae, свързана с абсцес на черния дроб.

Хранителна К. пневмония може да бъде потенциален резервоар на гени за резистентност към антибиотици.

Необходими са добра храна и лична хигиена, за да се помогне за ограничаване на антимикробната устойчивост.

Случаите на замърсяване на храните, причинени от агенти, различни от по-често съобщаваните патогени като Salmonella, Escherichia coli и Campylobacter, не са нечувани (6, 25, 44). В Сингапур се внасят повече от 90% от местните хранителни запаси и поради това е разумно да се проявява бдителност към често срещани и неочаквани замърсители в храните, като K. pneumoniae и други бактерии, за които е известно, че крият антибиотична резистентност. В Сингапур информацията като степента на разпространение в храните на дребно, профилите на устойчивост на антибиотици и характеристиките на вирулентност, които са необходими за оценка на рисковете от хранителна K. pneumoniae за общественото здраве, са ограничени. Местните нива на заболеваемост от хранителни K. pneumoniae, причиняващи заболяване, също не са налични. Като се имат предвид тези пропуски в знанията, тристранно изходно проучване на K. pneumoniae в храните на дребно беше инициирано като сътрудничество между Националната агенция по околна среда и Сингапурската болница. Това проучване има за цел да определи степента на позитивност, потенциала на вирулентност и профилите на резистентност към антибиотици на хранителна K. pneumoniae. Събраните данни ще допринесат за разбирането ни за потенциалния риск от K. pneumoniae за хигиената на храните на дребно, безопасността на храните и общественото здраве в Сингапур.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Общ работен поток

Проведено е проучване, за да се разбере по-добре разпространението на K. pneumoniae в сурови и варени храни на дребно. Това проучване включва тестване на сурови и RTE храни, предлагани на дребно за K. pneumoniae: молекулярен скрининг на изолирани K. pneumoniae за детерминанти на вирулентност и след това тестване на изолатите за устойчивост срещу редица антибиотици. Общият работен процес на изследването е даден на фигура 1.

Общ работен поток за изолиране и характеризиране на хранителни K. pneumoniae.

Общ работен поток за изолиране и характеризиране на хранителни K. pneumoniae.

Вземане на проби от сурова и RTE храна

Общо 698 проби от храна бяха събрани за микробиологичен анализ от 2014 до 2017 г. От тях 146 проби бяха сурови хранителни продукти от мокри пазари и супермаркети, а 552 проби бяха ястия от храна RTE, събрани от центрове за търговия в Сингапур. При закупуване пробите се държат на лед и незабавно се доставят в лабораторията за микробиологично изследване. Изборът и събирането на проби от храна за RTE е част от по-голяма, отделна програма за наблюдение, която определя микробиологичното качество на храната от RTE в сингапурските центрове. Хранителните продукти са изброени в таблица 1.

Позитивност, вирулентност и устойчивост на много лекарства на K. pneumoniae в проби от сурова и готова за консумация храна

Откриване на K. pneumoniae в проби от храни

За всяка проба храна, 10 g се суспендират в 90 ml универсален бульон за предварително обогатяване (Acumedia, Lansing, MI) и се хомогенизират в продължение на 30 s при 230 rpm в циркулатор Seward Stomacher 400. След това суспензията се инкубира при 37 ° С в продължение на 24 часа. След инкубация, 10 μL примка от суспензията се нанася върху агар на MacConkey (Oxoid, Basingstoke, UK) и се инкубира отново при 37 ° С за 24 часа. Колонии, проявяващи розова мукоидна морфология, характерна за K. pneumoniae, бяха подбрани и възрастени на триптичен соев агар (TSA; Oxoid) в продължение на 18 ± 2 h, за да се получат пресни култури, необходими за допълнително потвърждение чрез PCR и API 20E (bioMérieux, Marcy l'Etoile, Франция ).

Потвърждение на K. pneumoniae чрез PCR

Нуклеиновите киселини бяха извлечени от изолатите на K. pneumoniae чрез вътрешен метод на кипене. Предполагаемите колонии на K. pneumoniae бяха взети от TSA и инокулирани в отделни флакони, съдържащи 200 μL Tris буфер (1 х тетрациклинов [TE] буфер, рН 8.0; Amresco, Solon, OH). Всеки флакон се нагрява при 95 ° С в продължение на 10 минути; След това флаконите се охлаждат върху лед за още 10 минути и се центрофугират при 8000 × g в продължение на 20 минути. За извършване на анализ чрез PCR се запазват 100 μL (минимална концентрация ~ 50 ng/μL) ДНК, като се използват праймерите и условията, описани от Liu et al. (31) и Turton et al. (45), предоставено в Таблица 2. Амплифицираните продукти се визуализират с помощта на комплект за скрининг на ДНК Qiaxcel (Qiagen, Hilden, Германия).

Праймери и PCR условия, използвани за потвърждаване на K. pneumoniae и откриване на гена bla-KPC, свързан с резистентност към карбапенем

Биохимично потвърждение на K. pneumoniae чрез API 20E

Изолатите, потвърдени като K. pneumoniae чрез PCR, бяха допълнително анализирани чрез API 20E, за да се провери идентичността на колониите, които ще се използват за тестване на антибиотична резистентност. Подозираните колонии на K. pneumoniae се поставят върху TSA и се инкубират в продължение на 18 ± 2 h. Колониите се прехвърлят в 5% физиологичен разтвор, за да се достигне стандартна мътност ∼0,5 на McFarland. След това суспензията от бактерии и физиологичен разтвор се инокулират във всяка ямка на цветната API 20E тест лента, съгласно инструкциите на производителя; След това тест лентите бяха инкубирани при 37 ° С за една нощ. Промените бяха интерпретирани с помощта на цветовото ръководство API 20E; съответните цифрови кодове бяха въведени в онлайн ресурса на APIWeb (www.apiweb.com), за да се определи идентичността на организма. Потвърдените изолати на K. pneumoniae се съхраняват в инфузионния бульон на мозъка на сърцето (Neogen, Lansing, MI) с 15% глицерол при -80 ° C.

Скрининг за детерминанти на вирулентност в хранителни изолати на K. pneumoniae

Когато чрез PCR се потвърди, че изолатите са K. pneumoniae, ДНК се екстрахира повторно с помощта на DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) и се изпраща в Сингапурската лаборатория по патология за обща болница за изследване на детерминанти на вирулентност (rmpA, wcaG и капсулни типове K1, K2, K54, K57, K5 и K20) според Turton et al. (45).

Профилиране на антибиотична устойчивост на хранителни изолати на K. pneumoniae

Следните изолати на K. pneumoniae бяха избрани за профилиране на антибиотична резистентност: изолати от сурова храна, независимо дали са открити фактори на вирулентност (n = 66) и изолати от храна с RTE, които имат поне един фактор на вирулентност или имат степен на позитивност на K. pneumoniae от поне 15% (n = 42). От тях обаче 11 изолати не могат да бъдат реанимирани от замразени запаси от глицерол, така че общо са анализирани 97 К. изолати на пневмония за чувствителност към антибиотици.

Чувствителността е тествана към 11 антибиотици (микрограма), принадлежащи към следните осем класа: пеницилин (амоксицилин-клавуланова киселина, AMC 30; ампицилин, AMP 10), цефалоспорин (трето поколение цефтриаксон, CRO 30), тетрациклин (TE 30), хлорамфеникол (C 30), аминогликозид (амикацин, AK 30; гентамицин, CN 10), сулфонамид (сулфаметоксазол-триметоприм, SXT 25), хинолон (налидиксинова киселина, NA 30) и флуорохинолон (ципрофлоксацин, CIP 5; норфлоксацин, NOR 10) въз основа на дифузионния метод на Кирби-Бауер (4). Граничните стойности на резистентност следват тези, посочени в Института за клинични и лабораторни стандарти „Стандарти за ефективност при тестване на антимикробна чувствителност“ (7). Генът bla-KPC, свързан с резистентност към карбапенем антибиотици, е скриниран чрез PCR, следвайки протокола, описан от Hindiyeh et al. (23), както е описано в таблица 2.

Индексът на множествена антибиотична резистентност (MAR) се изчислява като съотношението на броя антибиотици, на които K. pneumoniae е резистентен, към общия брой антибиотици, на които е бил изложен организмът (29). Стойностите на индекса бяха установени като инструмент за оценка на риска, за да се определи дали бактериалните изолати са от източници на висока или ниска употреба на антибиотици, като стойности, по-големи от 0,2, показват излагане на източници, които са били силно изложени на антибиотици (10).

РЕЗУЛТАТИ

Положителност на K. pneumoniae в сурова и RTE храна

Като цяло K. pneumoniae е открита в 21% (147 от 698) сурови и RTE проби от храни, събрани от цял ​​Сингапур. По-висока степен на позитивност на K. pneumoniae се наблюдава при сурови храни (45%, 66 от 146) в сравнение с проби от RTE (15%, 81 от 552). K. pneumoniae е открит в 58% (50 от 86) сурови зеленчуци (бобови кълнове, пролетен лук, чили, магданоз, маруля, краставици, моркови и джинджифил) и 27% (16 от 60) суров пилешки и свински черен дроб . Сред пробите от храна на RTE, K. pneumoniae е открита в попия или пролетни ролки (33%, 3 от 9), ястия с птици (27%, 14 от 52), смесени зеленчукови оризови ястия (25%, 13 от 52) и каша (25%, 3 от 12). По-малко от 20% положителност на K. pneumoniae се наблюдава за всички други отделни тествани видове храни. Броят на K. pneumoniae, открити в специфични проби от храна, е показан в таблица 1.

Детерминанти на вирулентност, открити сред хранителни K. pneumoniae

Установено е, че осем процента (11 от 147) хранителни изолати на K. pneumoniae съдържат поне един (wcaG, K1, K2 или K54) от осемте скринирани фактора на вирулентност (wcaG и rmpA плазмидни гени и K1, K2, K5, K20, K54 и K57 капсулни видове); генът rmpA, свързан с абсцес на черния дроб, не е открит в изолатите на K. pneumoniae (0%, 0 от 147). Потенциално вирулентните изолати са както от сурова храна (5 от 11; от чилис, маруля, моркови и свински черен дроб), така и от RTE ястия (6 от 11; от ястия за птици, каша, юфка, напитка и свинско ястие ). От потенциално вирулентните изолати на K. pneumoniae, 3 от 11 са имали повече от един детерминант на вирулентност: генът wcaG и K1 капсулният тип са кодифицирани в чилис и в маруля, докато wcaG и капсулният тип K54 са кодектирани в ястие с юфка. WcaG и K1-положителният изолат на K. pneumoniae също е MDR. Останалите потенциално вирулентни изолати на K. pneumoniae осигуряват резистентност към ампицилин (9 от 11) или липса на резистентност към тестваните антибиотици (1 от 11). Таблица 1 показва факторите на вирулентност, открити сред хранителни K. pneumoniae.

Профили на антимикробна резистентност на хранителни K. pneumoniae

От 97-те хранителни K. pneumoniae, скринирани за антибиотична резистентност, 10% (10 от 97) са MDR, т.е. резистентни към поне три класа антибиотици (справка 33; Таблица 1). Половината (50%, 5 от 10) от тези изолати на MDR K. pneumoniae са от суров пилешки черен дроб; останалите изолати на MDR K. pneumoniae са от суров чилис (2 от 10), кълнове от боб (1 от 10), свински черен дроб (1 от 10) и варено ястие с птици (1 от 10). В допълнение, 3 от 10 изолати на MDR K. pneumoniae имат детерминанти на вирулентност (Таблица 1). Един MDR K. pneumoniae изолат (от сурови кълнове на боб) е бил устойчив на цефалоспорин от трето поколение (цефтриаксон).

Степента на антибиотична резистентност на K. pneumoniae, изолирана от сурова и RTE храна, е представена в Таблица 3. Около 98% (95 от 97) от тестваните изолати на K. pneumoniae са били устойчиви на ампицилин и 14% (14 от 97) са били устойчиви на тетрациклин. По-малко от 10% проценти на резистентност са наблюдавани за ципрофлоксацин (8%, 8 от 97), хлорамфеникол (7%, 7 от 97), сулфаметоксазол-триметоприм (6%, 6 от 97), амоксицилин-клавуланова киселина (5%, 5 от 97), налидиксинова киселина (2%, 2 от 97), амикацин (1%, 1 от 97) и цефтриаксон (1%, 1 от 97). Нито един изолат на K. pneumoniae (0 от 97) не показва резистентност към гентамицин или норфлоксацин.

Процент на антибиотична резистентност на 97 изолати, пренасяни от храна K. pneumoniae

Седемнадесет фенотипа на антимикробна резистентност са наблюдавани сред хранителни K. pneumoniae. Тези модели, заедно със съответните MAR стойности, които показват връзка с източници, силно изложени на антибиотици, са обобщени в Таблица 4. Повечето изолати (76%, 74 от 97) са били устойчиви само на ампицилин, 11% (11 от 97) са били устойчиви на антибиотици в два антибиотични класа, 10% (10 от 97) придават резистентност на три до шест антибиотични класа (MDR), а 2% (2 от 97) не са устойчиви на тестваните антибиотици. Около 12% (12 от 97) от изолатите на K. pneumoniae имат MAR индекс по-голям от 0,2.

Модели на резистентност към антибиотици и MAR индекс на 97 изолати, пренасяни от храна K. pneumoniae

ДИСКУСИЯ

От K. pneumoniae, изолирани от храна, около 8% (11 от 147) притежават генетични фактори, свързани с повишена вирулентност. Генът rmpA, регулатор на мукоидния фенотип, който е тясно свързан с придобитата в общността инфекция (50), не е открит. Генът wcaG, свързан с повишена вирулентност чрез кодиране на превръщането на захарта, за да направи K. pneumoniae неразпознаваем от макрофаги, задействащи фагоцитоза (2, 50), се наблюдава при 6% (9 от 147) изолати на K. pneumoniae. Капсулният тип K54, за който се съобщава, че има активност на β-лактамаза с разширен спектър и устойчивост на дезинфектанти (24), също се наблюдава в проба от RTE храна; този капсулен тип K54 е кодектиран с гена wcaG, но е податлив на всички антибиотици с изключение на ампицилин. Капсулни типове (K1 и K2), които често съжителстват с производството на аеробактин (43, 50) и са свързани с вътреболничен абсцес на черния дроб на K. pneumoniae и бактериемия (17, 49, 42), са открити на пет пъти (3%, 5 от 147 ).

В азиатските страни, особено в Тайван (18, 30), са съобщени връзки между абсцес на черния дроб и стомашно-чревен пренос на K. pneumoniae; подобни асоциации са по-рядко срещани извън Азия и в малкото съобщения за K. pneumoniae в червата, свързани с абсцес на черния дроб, случаите са от азиатски произход (30, 39). В поредица от случаи, включваща шестима азиатски пациенти, приети в американска болница поради абсцес на черния дроб на K. pneumoniae, стомашно-чревният тракт беше заподозрян като път за навлизане в един от случаите (34). През последните години стомашно-чревният превоз също се признава като рисков фактор за колонизацията на K. pneumoniae в неазиатски кохорти. В Австралия, например, проучване на вероятни събития на предаване на K. pneumoniae разкрива, че 48% (13 от 27) от пациентите в интензивно отделение са имали колонизация на червата преди инфекция (20).

За органите на общественото здраве решаването на проблема с устойчивите на антибиотици бактерии във веригата за доставка на храни изисква съгласувани, междуведомствени усилия. На международно ниво СЗО очерта глобален план за действие за справяне с антимикробната резистентност. Въпреки че би било идеално да се ограничи разпространението на антибиотичната резистентност чрез забрана върху употребата на антибиотици в земеделието и производството на храни, такива крайни ограничения могат да бъдат срещнати с противопоставяне. Повишените разходи за производство на храни поради намаляването на общия добив и размера на растежа на животните, както и увеличената честота на болести по животните и инфекции, предавани чрез храна (7, 12), когато антибиотиците не се използват, е проблем. По този начин както прилагането, така и регулирането на антибиотиците трябва да се извършват предпазливо. В Сингапур употребата на антибиотици за животни за отглеждане на храна е строго контролирана. Антибиотиците са разрешени само за лечение и профилактика на заболявания; използването на антибиотици за насърчаване на растежа не е разрешено и фермерите, внасящи в Сингапур, трябва да спазват периодите на оттегляне, специфични за всеки антибиотик, така че месото и месните продукти, влизащи в хранителните продукти на Сингапур, да съдържат само нива на следи от антибиотици или без тях.

Въпреки че е по-малко известно, че причинява хранителни заболявания, наличието на MDR и потенциално вирулентни (K1, K2 и K54 капсулни серотипове и wcaG) K. pneumoniae в храната предполага потенциален риск за общественото здраве, пряко като патоген или косвено като носител на антибиотик гени, които могат да бъдат предадени на други патогени в микрофлората на храната и човешките черва. Генът rmpA, за който е известно, че повишава вирулентността на K1 K. pneumoniae и е силно свързан с чернодробно заболяване на K. pneumoniae и придобита в общността инфекция, не е открит сред изолатите от храната, което не дава доказателства за връзката между храната и свръхвирулентната K. pneumoniae свързани с пиогенен абсцес на черния дроб.

ПРИЗНАВАНИЯ

Това изследване беше подкрепено от Националната агенция по околна среда и Сингапурската обща болница. Авторите признават служители от Института по екологично здраве, Национална агенция по околна среда; Д-р Aung Kyaw Thu за насоки относно профилирането на антибиотична резистентност; и д-р Joanne Kang Su Lin за споделяне на PCR протокола, използван за откриване на bla-KPC.