Експериментална фармакология и откриване на лекарства

Тази статия е част от изследователската тема

Напредък в биофармацевтиката Вижте всички 25 статии

Редактиран от
Салваторе Саломоне

Университет в Катания, Италия

Прегледан от
Ана Агиар-Рикардо

Факултет по науки и технологии, Нов университет в Лисабон, Португалия

Yanqi Ye

Университет на Северна Каролина в Чапъл Хил, САЩ

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

субмикронни

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Лаборатория за дистанционно управляеми терасични системи, Саратовски държавен университет, Саратов, Русия
  • 2 RASA център в Томск, Томски политехнически университет, Томск, Русия
  • 3 Център RASA, Казански федерален университет, Казан, Русия
  • 4 Катедра по биотехнологии, биоинженерство и биохимия, Национален изследователски университет Огарев Мордовия, Саранск, Русия
  • 5 Училище по инженерство и материалознание, Лондонски университет „Queen Mary“, Лондон, Великобритания
  • 6 Център за фотоника и квантови материали на Сколтех, Институт за наука и технологии „Сколково“, Иновационен център „Сколково“, Москва, Русия
  • 7 Фармакология и токсикология, Rutgers University, Piscataway, NJ, САЩ

Въведение

Доставянето на лекарства до долната дихателна част на белия дроб е дългогодишна и желана цел. Дисталната част на белия дроб е желана цел за системно доставяне, тъй като има голяма повърхност (∼70–140 m 2); тясната бариера за дифузия и относителната липса на разграждащи се ензими (Groneberg et al., 2003). Освен това доставката на съединения в дихателната част е важна цел за много белодробни заболявания. Според проекта за изследване на глобалната тежест на заболяванията, четири от петнадесетте най-разпространени причини за смърт се появяват в дихателната част на белия дроб. В прогнозата за 2030 г. се очаква всички тези болести да се увеличат по отношение (Mathers and Loncar, 2006). За лечението на тези заболявания, проектирането на системи за доставка, насочени специално към дисталните бели дробове, е потенциално от голямо значение.

След всеки синтез частиците се утаяват чрез центрофугиране за 1 min при 3000 ж за микронови частици и при 6000 ж за субмикронни частици и последващо трикратно измиване с дейонизирана вода и еднократно измиване с етанол. След това получената утайка се изсушава в продължение на 1 h при + 60 ° С. За да се изследва морфологията и микроструктурата, изсушени частици се разпръскват със злато и се изобразяват със сканиращи електронни микроскопи (SEM), MIRA II LMU (Tescan) при работно напрежение 30 kV.

Етикетиране на ватеритови частици с конюгиран Cy7-BSA

Флуоресцентното багрило от Cy7 се разтваря в безводен DMSO (4: 1), добавя се към 50 ml 2% BSA в PBS, рН 8.3 и се разбърква една нощ при + 4 ° С. Полученият конюгиран Cy7 разтвор на BSA се промива от излишните реактиви чрез обширна диализа във вода. Конюгираният Cy7-BSA (2 ml) се смесва с 5 mg от получените изсушени CaCO3 частици и се инкубира в продължение на 1 h разклащане при стайна температура. Частиците с размер на микрона се центрофугират при 3000 ж за 1 min субмикронни частици се центрофугират при 6000 ж за 1 мин. След това супернатантите бяха отстранени и събрани. Концентрацията на флуоресцентното багрило се определя фотометрично с помощта на спектрофотометър (Synergy H1) според калибрационната линия, определяща относителната зависимост на флуоресцентните единици (RFU) и известната концентрация. Конфокален микроскоп Leica TCS SP8 X (Leica Microsystems) е използван за визуализиране на получените маркирани частици ватерит.

Взаимодействие на частици на ватерит с повърхностноактивно вещество инвитро

Получените частици ватерит с размер 0,65 μm се инкубират при концентрация 10 mg/ml с дейонизирана вода, физиологичен разтвор, малки или големи фракции на ПАВ с постоянно разклащане при 37 ° C в посочени моменти от време (1, 3, 5, 7, 9, 24, 32, 56, 96 и 144 часа), пробите бяха анализирани за морфология на частиците със сканираща електронна микроскопия MIRA II LMU (Tescan).

Животни

Всички животни за това проучване са настанени в Института за грижа за животните на Държавния университет в Огарев Мордовия при стандартни условия със свободен достъп до храна и вода. Всички процедури с животни са извършени съгласно протокол, одобрен от Институционалните комитети за грижа и употреба на животните към Медицинския институт на Държавния университет в Огарев Мордовия (протокол № 50 на Етичната комисия от 20.05.2017 г.). Balbc мишки, смесена популация на възраст 6-8 седмици, бяха евтаназирани със смес Zoletil (40 mg kg-1, 50 μl, Virbac SA, Carros, Франция) и 2% Rometar (10 μl и 10 mg kg-1, Spofa, Чехия) чрез интраперитонеална инжекция.

Подготовка на бронхоалвеоларен лаваж

Бронхоалвеоларният лаваж (BAL) се извършва с 0,5 ml аликвоти от стерилен физиологичен разтвор до общ обем от 10 ml, както е описано (Guo et al., 2008). Възстановените BAL проби се центрофугират при 400 ° С ж при 4 ° C в продължение на 10 минути за отстраняване на клетките и безклеточните супернатанти на BAL се разделят на големи (LA) и малки (SA) агрегатни повърхностноактивни фракции чрез центрофугиране (20 000 ж за 60 минути при 4 ° С), както е описано по-рано (Atochina et al., 2004). Пелираната биофизично активна LA фракция се суспендира отново в стерилен физиологичен разтвор и се замразява при -20 ° С до анализ. Супернатантът от високоскоростното центрофугиране, SA фракция, която съдържа разтворими протеини и биофизично неактивни повърхностноактивни форми, се прехвърля в прясна епруветка и също се замразява при -20 ° C за бъдещ анализ.

Биоразпределение на ватеритовите частици в Vivo

Маркирани с BSA-Cy7 частици (0,65, 1,35 и 3,15 μm) се прилагат интратрахеално на 6–8 седмични Balb/c мишки, както е описано по-рано (Atochina-Vasserman et al., 2009). BSA-Cy7 конюгат самостоятелно се използва като контрол, дозата на флуоресцентно багрило Cy7 е 300 ng за всяка инжекция. Всички мишки (н = 3–4 за всяка група) са изобразени преди инжектиране и 5, 20 минути и 24, 48 и 72 часа след инжектирането. След интратрахеална инстилация поведението и благосъстоянието на мишките останаха нормални и дишането беше стабилно под анестезия. След всички манипулации физическата активност и апетитът на мишките бяха нормални в продължение на 3 дни, преди да бъдат жертвани.

В определено време след приложение на частици (24, 48 и 72 часа), биоразпределението на флуоресцентния сигнал в белите дробове, черния дроб, бъбреците, стомаха и червата на живи и анестезирани мишки беше анализирано с помощта на IVIS® Lumina система за изображения (Xenogen Corp.) с набор от филтри ICG (възбуждане, 710–760 nm; излъчване, 810–875 nm). Всички флуоресцентни изображения са получени с експозиция 5 s и са нормализирани чрез разделяне на флуоресцентните изображения с референтни изображения на осветление. Интензитетът на луминесценцията е количествено определен с помощта на софтуера Living Image (Xenogen Corp). За да се получат цифрови данни за нивото на интензивност в интересуващия регион, се обработва последваща обработка на изображенията с помощта на софтуера Fiji 1 Полученото ниво на флуоресценция на интересуващата област се изчислява като разликата между лъчистата ефективност в определен момент от времето и началното ниво (време 0) за всяка мишка.

Конфокално флуоресцентно изображение на белия дроб

Двадесет минути след администриране на частици с размер 0,65 μm/BSA-Cy7, мишките се умъртвяват, белите дробове се отстраняват, промиват се с физиологичен разтвор и се замразяват в криостат Leica със среда за замразяване на тъкани. Приготвените участъци с дебелина 15 μm бяха анализирани с лазерно сканиращ конфокален микроскоп (Leica TCS SP8 X). Лазерът се възбужда при 670 nm. Изображенията са записани с помощта на два флуоресцентни канала: диапазон от 680–726 nm, съответстващ на автофлуоресценция на белодробната тъкан и 747–794 nm спектър, съответстващ на флуоресцентното багрило Cy7. Записани са и оптични изображения на пробата.

z-технологията на стека е използвана за локалната тъканна триизмерна визуализация, където ватеритните частици се отлагат в алвеоларното пространство. След избиране на интересуващата област за криосекцията на белодробната проба с накапани частици, покрити с флуоресцентно багрило, z-беше извършен обхват на сканиране на ос, перпендикулярен на равнината на криосекция. Етапът на формиране на конфокалните равнини е не повече от 0,2 μm. След приключване на процедурата за сканиране на проби в определения диапазон, софтуерът Las X Leica извърши триизмерна реконструкция на региона, който представлява интерес. Записът на флуоресцентни изображения е направен в същите канали, които са описани в параграф по-рано.

Фармакокинетика

Мишките бяха инжектирани интратрахеално с частици с размер 0,65 μm, адсорбирани с флуоресцентно багрило Cy7 от алкохолния разтвор или с BSA-Cy7-конюгат. Като контрола се използва флуоресцентно багрило Cy7 в 0,01% алкохолен разтвор. Дозата на багрилото Cy7 във всеки отделен случай е 300 ng. В посочени времеви точки (5, 15 и 45 минути, 1,5, 3, 6, 9, 24 и 48 часа) след приложение, 50 μl кръвни проби се вземат през ретроорбиталния синус през стъклен хематокритен капиляр, смесен с хепарин в съотношение 5/3. Относителната интензивност на флуоресцентните единици (RFU) беше измерена със спектрофотометър Synergy H1 (BioTek Instruments, Inc.) с възбуждане при 720 nm, емисионният спектър при 750–800 nm със стъпки от 1 nm. Емисионният спектър на флуоресцентното багрило Cy7 има пик при 773 nm. За всяка концентрация беше изчислено колко се е увеличила стойността на относителната флуоресцентна единица (RFU) в сравнение с нулевата концентрация в посочения диапазон, т.е. изчислява се следното съотношение:

Където „I“ е коефициент на нарастване на интензитета, а „λ“ - дължина на вълната на спектрите. Обобщението на RFU сигнала се изчислява от 765 до 785 nm на стъпки от 1 nm.

Статистика

За теста ANOVA сайтът беше използван http://vassarstats.net (Еднопосочен дисперсионен анализ за независими или корелирани проби), който също извършва двойни сравнения на пробните средства чрез тест Tukey HSD, който сравнява всички възможни двойки от означава и използва Studentized разпределение на обхвата. Две двойки (вода/физиологичен разтвор и малка/голяма агрегатна фракция) бяха сравнени, за да се определи статистическата значимост на получените резултати при изследване на динамиката на прекристализация на ватеритовите частици в четири различни разтвора. В проучване за биоразпределение всички стойности на лъчиста ефективност за отделни органи във всяка група са сравнени във всяка времева точка (24, 48 и 72 часа). Кривите на фармакокинетиката за приложението на три различни вещества бяха сравнени. Бяха установени две нива на значимост (стр ∗ стр ∗∗ стр ∗ стр ∗∗ стр Ключови думи: ватеритни частици, белодробно доставяне на лекарства, удължено освобождаване, биоразпределение, зависещо от размера, носители на лекарства

Цитиране: Gusliakova O, Atochina-Vasserman EN, Sindeeva O, Sindeev S, Pinyaev S, Pyataev N, Revin V, Sukhorukov GB, Gorin D and Gow AJ (2018) Използването на субмикронни ватеритни частици служи като ефективно средство за доставка до дихателните пътища Част от белия дроб. Отпред. Pharmacol. 9: 559. doi: 10.3389/fphar.2018.00559

Получено: 03 февруари 2018 г .; Приет: 10 май 2018 г .;
Публикувано: 04 юни 2018 г.

Salvatore Salomone, Università degli Studi di Catania, Италия

Yanqi Ye, Университет на Северна Каролина в Chapel Hill, САЩ
Ана Агиар-Рикардо, Университет Нова де Лисабон, Португалия