Експериментална ендокринология

Редактиран от
Д-р Сомен К. Майтра

Университет Вишва-Бхарати, Индия

Прегледан от
Такаши Йошимура

Университет Нагоя, Япония

Сиен-Хуей Чунг

Национален университет Cheng Kung, Тайван

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

затлъстяване

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Програма за следдипломно обучение по химическа биология, Институт по екологични науки, химически и фармацевтични продукти, Федерален университет на Сао Пауло-UNIFESP, Диадема, Бразилия
  • 2 Катедра по експериментална и клинична медицина, Университет в Анкона (Politecnica Delle Marche), Анкона, Италия
  • 3 Център за затлъстяване, Университет в Анкона (Politecnica Delle Marche), Анкона, Италия
  • 4 Катедра по биологични науки, Институт за науките за околната среда, химически и фармацевтични продукти, Университет Федерал де Сао Пауло-UNIFESP, Diadema, Бразилия

Въведение

Затлъстяването е световен проблем и представлява сериозно предизвикателство за общественото здраве за 21 век. През 2016 г. Световната здравна организация (СЗО, 2019) посочи, че 1,9 милиарда възрастни на възраст над 18 години са с наднормено тегло, от които над 650 милиона са със затлъстяване и около 3,4 милиона възрастни умират всяка година поради съпътстващи заболявания, свързани със затлъстяването, като хипертония, сърдечни заболявания, дислипидемия, затлъстяване на черния дроб, диабет тип 2 и някои видове рак. Затлъстяването е резултат от критични периоди на положителен енергиен баланс, характеризиращ се с калориен прием, по-голям от енергийния разход, където излишъкът от калории от диетата се съхранява в бяла мастна тъкан (WAT) под формата на триацилглицероли (TAG). Увеличаването на мастната маса може да се случи чрез два процеса: хипертрофия на адипоцитите или хиперплазия на адипоцитите (чрез de novo разграничаване от родоначалниците) (1). Известно е, че хипертрофията на адипоцитите води до болестно затлъстяване (2, 3), характеризиращо се с бърз растеж на мастните депа чрез увеличаване на съществуващите мастни клетки, което е придружено от висока степен на инфилтрация на макрофаги М1, ограничено развитие на съдовете и масивна фиброза (3). Имайки предвид тези факти, такова патологично разширяване е свързано с хронично възпаление и дисфункция на WAT.

Дисфункцията на WAT със сигурност е една от основните причини за свързаните със затлъстяването медицински съпътстващи заболявания, тъй като тази тъкан е една от първите, които развиват възпалителни реакции, задействащи активирането на класическите провъзпалителни пътища, обострена инфилтрация на макрофаги, неутрофили, лимфоцити и индукция на широка гама секреция на провъзпалителни медиатори (4, 5), което в крайна сметка води до развитие на системна инсулинова резистентност. Много терапевтични стратегии се използват за подобряване на това състояние, предизвикано от тази тъканна дисфункция. Според някои проучвания използването на мелатонин, хормон, произвеждан от епифизата само през нощта и отговорен за синхронизирането на безброй физиологични ефекти, е свързано с благоприятните ефекти върху контрола на затлъстяването и неговите усложнения (6–9).

Освен това са показани важни мелатонинови ефекти в енергийния метаболизъм (10, 11) и действието на инсулина върху метаболизма на глюкозата и липидите, като много от тези изследвания са свързани с WAT от гризачи, докладвани от нашата група (12-16). Освен това са описани хронобиологични аспекти на мелатонина и неговата взаимовръзка с цитокини, произведени от WAT като лептин и адипонектин (17, 18).

Друг важен ефект, описан за мелатонина, е противовъзпалително действие, което се проявява главно поради неговата активност като митохондриален протектор (19), като предотвратява инсулиновата резистентност (20, 21), както и да играе роля в имунната система, насърчавайки понижаване на регулацията на противовъзпалителните и повишаване на противовъзпалителните плазмени цитокини в животински модели на метаболитен синдром (22, 23).

Всички гореспоменати проучвания засилват терапевтичния потенциал за мелатонин при лечение на затлъстяване и свързаните с него усложнения. Като се има предвид, че затлъстяването води до дисфункция на основните метаболитни процеси на WAT (липолиза, липогенеза и адипогенеза), настоящото проучване има за цел да оцени дали мелатонинът е ефективен за отслабване или дори блокиране на щетите в WAT, причинени от поглъщането на високо -мазнинна диета (HFD), както и подобряване на възпалителното състояние, предизвикано от затлъстяването, предизвикано от HFD при мишки.

Материали и методи

Животни и добавка на мелатонин

Всички процедури бяха одобрени от Комитета по етика за използване на животните към Федералния университет в Сао Пауло. Осемседмични мъжки мишки C57BL/6 бяха поддържани при контролиран цикъл светлина-тъмнина (12 часа: 12 часа цикъл на светлините в 0600), температура 24 ± 1 ° C и относителна влажност 53 ± 2%. Мишките са получени от Центъра за разработване на експериментални модели (CEDEME), Федерален университет в Сао Пауло. Те бяха разпределени на случаен принцип в три групи: (a) контролна (нискомаслена) диета (Control), (b) HFD (затлъстяване) и (c) HFD, допълнено с мелатонин (затлъстяване + Mel). Контролната диета съдържа 76% въглехидрати, 15% протеини и 9% мазнини, а HFD съдържа 26% въглехидрати, 15% протеини и 59% мазнини, в% kcal.

По време на индукция на затлъстяването животните са били добавяни с мелатонин (1 mg/kg) в питейна вода по време на тъмната фаза, ежедневно, в продължение на 10 седмици. Телесното тегло и приемът на храна се измерват ежеседмично и хранителната и енергийната ефективност се изчисляват чрез съотношението на наддаването на телесно тегло (g) към поглъщането на храна (g) или чрез съотношението на наддаването на телесно тегло (g) към приема на калории (kcal). След 10 седмици от експерименталния протокол, 12-часови гладни мишки се анестезират с изофлуран и се подлагат на вземане на кръв чрез пробиване на орбиталния сплит. Животните бяха евтаназирани и тъканите бяха отстранени след изкълчване на шийката на матката. Депа с мастна мазнина: ING (подкожно ингвинално), EPI (епидидимно), RP (ретроперитонеално) и BAT (междускапуларна кафява мастна тъкан) бяха събрани и претеглени. След това ING депо се обработва за RT-qPCR, изолиране на адипоцити и биологични анализи.

Измервания на кръвта

Нивата на триацилглицерол, общ холестерол, LDL-холестерол и HDL-холестерол се определят чрез колориметрични анализи (Labtest Diagnostics, Lagoa Santa, MG, Бразилия).

Изолиране на адипоцити

Изолирането на адипоцити се извършва, както е описано по-рано (24). Накратко, ING мастните накладки бяха нарязани на малки фрагменти в колба, съдържаща 4 ml DMEM, допълнена с HEPES (20 mM), глюкоза (5 mM), говежди серумен албумин (BSA, 1%) и колагеназа тип II (1 mg/mL), рН 7.4 и се инкубира в продължение на 40 минути при 37 ° С в орбитален шейкър. Изолираните адипоцити се филтрират през пластмасова мрежа (150 μm) и се промиват три пъти в същия буфер без колагеназа. Адипоцитите са снимани под оптичен микроскоп (увеличение 100 ×), свързан с микроскопска камера (AxioCam ERc5s; Zeiss, Oberkochen, Alemanha), и среден обем на адипоцитите (4/3 × π × r 3) беше определено чрез измерване на 100 клетки с помощта на софтуера AxioVision LE64.

Екстракция на РНК и количествена верижна реакция на полимераза в реално време (qPCR)

Общата РНК беше извлечена от ING депо, преписана обратно и предназначена за количествен анализ на qPCR, както беше описано по-рано (25). Анализът на PCR данните в реално време се извършва с помощта на метода 2 T - Δ Δ C. Данните се изразяват като съотношение между експресията на целевия ген и домакинския ген (18S ген). Използваните грундове са представени в допълнителна таблица 1.

Измерване на липолиза

Липолизата се оценява като скорост на глицерол (комплект за определяне на свободен глицерол, Sigma), отделен от ING изолирани адипоцити по време на 30 минути инкубация (24). Резултатите са изразени като наномоли глицерол на 106 клетки.

Включване на [1- 14 С] -палмитат в триацилглицерол

ING адипоцитите бяха инкубирани в KRH (Krebs Ringer Hepes бикарбонатен) буфер, pH 7.4, съдържащ 1% BSA и 2 mM глюкоза плюс палмитат (200 μM), наситен с газова смес от 95% O2 и 5% CO2, [1- 14 След това към буфера се добавя С] -палмитат (1850 Bq/епруветка или ямка) и се оставя за 2 часа при 37 ° С. След това клетките се промиват три пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и реагентът на Dole, съдържащ изопропанол: n-хептан: H2SO4 (4: 1: 0.25 vol/vol/vol), се добавя към останалата реакционна смес за липидна екстракция (24). Радиоактивността, уловена в TAG, се определя с помощта на β-брояч (1450 LSC, брояч MicroBeta, Trilux; PerkinElmer). Резултатите са изразени като наномоли на FA на 106 клетки.

Консумация на кислород

Скоростите на консумация на кислород в изолирани клетки са измерени като индикация за митохондриална дихателна активност. Изолираните от ING клетки от животни внимателно се суспендират отново в KRH (рН 7,4), съдържащ BSA (0,1%) и се прехвърлят в оксиграфа (OROBOROS Oxygraph-2 k). Камерите на оксиграфа преди това са били уравновесени с KRH, съдържащ BSA 0,1% при 37 ° С. Карбонил цианид m-хлорофенил хидразин (CCCP, 1 μM f.c.) беше добавен като положителна контрола за определяне на максимална дихателна честота (разединяване). Степента на консумация на кислород се нормализира според броя на клетките и се изразява като% от контролата (26).

Перфузия, фиксиране, дехидратация и вграждане

За хистохимичен и имунохистохимичен анализ животните под дълбока анестезия (100 mg/kg кетамин с 10 mg/kg ксилазин) се инфузират интракардиално с 250 ml 0,9% физиологичен разтвор, последвано от 300 ml фиксиращ разтвор [4% параформалдехид в 0,1 М фосфатен буфер (PBS), рН 7,4]. Мастното депо на ING беше отстранено и постафиксирано за 12–15 h при 4 ° C. Тъканта се измива във фосфатен буфер, за да се отстрани всякакъв остатъчен фиксатор и впоследствие се дехидратира с градуиран етанол (от 50 до 100%) и се изчиства в разтворител (ксилол), смесващ се с парафин преди импрегниране при 55 ° С и накрая се влага в парафин.

Светлинна микроскопия и морфометрия

Серийни парафинови участъци с дебелина 4 μm са получени от тъкан ING и са монтирани върху филийки. Някои бяха оцветени с хематоксилин и еозин (H&E), за да се оцени морфологията; останалите са използвани за имунохистохимични процедури (н = 6 за всяка процедура) (27). Размерът на адипоцитите се изчислява като средната площ на адипоцитите от 300 произволни адипоцити (100 на секция) от всяко депо на всяка мишка с помощта на таблетка за рисуване и софтуера Nikon Lucia Image (версия 4.61) на морфометричната програма. Разрезите на тъкани бяха наблюдавани със светлинен микроскоп Nikon Eclipse E800 (Nikon Instruments, Firenze, Италия), използвайки 20X обектив, а цифровите изображения бяха заснети с камера Nikon DXM 1220.

Имунохистохимичен анализ

Оценката на инфилтрацията на макрофаги и плътността на подобна на корона структура (CLS) в пробите на мастната тъкан беше извършена чрез имунохистохимия срещу MAC-2/galectin-3, маркер на активирани макрофаги, върху парчета, вградени в парафин. Основното антитяло е моноклонално анти-MAC-2 антитяло от плъх (разреждане 1: 1500; Cedarlane Laboratories, Burlington, Онтарио, Канада). Имунохистохимични и морфометрични анализи са извършени съгласно Giordano et al. (27).

Статистически анализ

Данните са представени като средно ± SEM. За сравнение между групите бяха използвани еднопосочен ANOVA и Bonferroni или Tukey post-test. Тест-т се използва за проверка на разликите само между групите със затлъстяване и затлъстяване + Mel. За анализ е използван софтуерът GraphPad Prism 5.1 (GraphPad Software, Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ). Нивото на значимост беше определено на стр * P # P * P * P # P * P # P -14] - включване на палмитат в TGA (включени наномоли [1 -14 С] - палмитат на 10 6 клетки); (Б) Липолитичен капацитет; (° С) нивата на иРНК на Lpl; (Д) нивата на иРНК на Агпат-2; (E) нивата на иРНК на Dgat-2; (F) нивата на иРНК на Hsl; (G) нивата на иРНК на Atgl. Мишките бяха хранени с контролна диета (Control) или HFD (затлъстяване), допълнена или не с Mel (затлъстяване + Mel). Резултатите бяха анализирани чрез еднопосочен ANOVA и Tukey пост-тест. Стойностите са средни ± SEM (н = 6–8 до метаболитни дейности и н = 9–13 към генния анализ). * P # P * P # P * P # P Ключови думи: подкожни мазнини, цитокини, възпаление, триацилглицерол, холестерол, намаляване на телесното тегло, CLS

Цитиране: Farias TdSMd, Cruz MM, Sa RCdCd, Severi I, Perugini J, Senzacqua M, Cerutti SM, Giordano A, Cinti S и Alonso-Vale MIC (2019) Добавката на мелатонин намалява хипертрофичното затлъстяване и възпалението, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини Мишки. Отпред. Ендокринол. 10: 750. doi: 10.3389/fendo.2019.00750

Получено: 28 август 2019 г .; Приет: 16 октомври 2019 г .;
Публикувано: 05 ноември 2019 г.

Saumen Kumar Maitra, Университет Visva-Bharati, Индия

Hsien-Hui Chung, Национален университет Cheng Kung, Тайван
Такаши Йошимура, Университет Нагоя, Япония