Джошуа М. Стърн

1 Катедра по урология, Медицински колеж Алберт Айнщайн, Бронкс, Ню Йорк,

Марсия Урбан-Малдонадо

1 Катедра по урология, Медицински колеж Алберт Айнщайн, Бронкс, Ню Йорк,

Михайло Усик

2 Катедра по микробиология, Медицински колеж Алберт Айнщайн, Бронкс, Ню Йорк,

Игнасио Гранджа

3 Litholink Corporation, Чикаго, Илинойс,

Даниел Шьонфелд

1 Катедра по урология, Медицински колеж Алберт Айнщайн, Бронкс, Ню Йорк,

Келвин П. Дейвис

1 Катедра по урология, Медицински колеж Алберт Айнщайн, Бронкс, Ню Йорк,

Илир Агалиу

4 Катедра по епидемиология, Медицински колеж Алберт Айнщайн, Бронкс, Ню Йорк,

Джон Асплин

3 Litholink Corporation, Чикаго, Илинойс,

Робърт Бърк

2 Катедра по микробиология, Медицински колеж Алберт Айнщайн, Бронкс, Ню Йорк,

Силвия О. Суадикани

1 Катедра по урология, Медицински колеж Алберт Айнщайн, Бронкс, Ню Йорк,

Резюме

Болестта на пикочните камъни (USD) е основен проблем за здравето. Необходими са нови начини на лечение. Наскоро нашата група предостави доказателства за връзка между състава на GMB и щатския долар. Достъпността на чревния микробиом (GMB) го прави привлекателна цел за изследване и следователно в тези проучвания сме оценили степента, до която цялата микробна общност на червата при фекални трансплантации може да повлияе на параметрите на рисковия камък в животински модел. Пресни фекални пелети бяха събрани от постни плъхове на Zucker, хомогенизирани в PBS (100 mg/mL), филтрирани през цедка 70 μm и след това орално дадени в C57 BL/6 NT ac без микробни мишки. Двадесет и четири часа събиране на урина и анализ на GMB са извършени с течение на времето в продължение на 1 месец. Бъбречна и чревна тъкан са събрани от трансплантирани мишки за Western blot анализ на нивата на експресия на транспортера Slc26a6, участващ в оксалатния баланс. Калцият в урината намалява след фекална трансплантация с 55% (рН от изходно ниво от 5,85 (SE ± 0,028) до 6,49 (SE ± 0,04) (P USD; достъпността на GMB потенциално може да се използва за терапевтични интервенции).

Въведение

Болестта на пикочните камъни (USD) е нарастваща тежест за общественото здраве в САЩ, свързана с повишен риск от загуба на бъбречна функция (Alexander et al. 2012), сърдечни заболявания (Ferraro et al. 2013) и костна фрактура (Melton et al . 1998 г.), което води до годишни разходи за здравеопазване над 10 милиарда щатски долара (Litwin and Saigal 2012). Последният напредък в секвенирането на човешкия чревен микробиом (GMB) доведе до иновативни пробиви, които описват връзката му с важни резултати за човешкото здраве, като астма, възпалителни заболявания на червата и сърдечно-съдови заболявания (Black et al. 2015; Knoll et al. 2016; Butto и Haller 2017). Наскоро нашата група предостави доказателства за връзка между състава на GMB и щатския долар (Stern et al. 2016).

Методи

Фекална трансплантация

Микробиомни анализи

Методите за 16S рРНК амплификация и секвениране бяха извършени, както е описано по-рано (Smith et al. 2012, 2016; Ghartey et al. 2014; Zhang et al. 2015; Stern et al. 2016; Usyk et al. 2017). Накратко, фекални проби бяха извлечени за обща ДНК, използвайки процедурата за биене на зърна на изолационния комплект за ДНК MoBio PowerSoil (лаборатории Qiagen, САЩ). Микробиомът се характеризира с използване на уникални баркодирани праймери за всяка проба, която усилва 16S рРНК V4 областта. PCR продуктите бяха потвърдени чрез гел анализ, обединени, изолирани и беше създадена библиотека, използваща KAPA комплект за подготовка на библиотеки (Kapabiosystems, Wilmington MA) с адаптери TruSeq. ДНК библиотеката, съдържаща баркодирани ДНК ампликони, беше секвенирана на Illumina MiSeq (Illumina Inc., Сан Диего, Калифорния) в Epigenomics and Genomics Core Facility в Айнщайн, използвайки 300 bp сдвоена химия.

Биоинформатика

Събиране на урина

Бяха проведени два кръга от 24-часово събиране на урина на донорски плъх и на реципиентни мишки във всяка от точките от времето в проучването. Изхвърлената урина се събира непрекъснато в резервоара на метаболитната камера, съдържащ минерално масло (0,5 ml, за да се сведе до минимум изпарението) и тимол (1-ви кръг; некисели проби) или минерално масло и 4N HCl (2-ри кръг; 5/100 μL урина; подкиселена проба) Анализираните параметри на урината включват калций, оксалат, пикочна киселина, цитрат, NH4, сулфат, pH, креатинин, фосфат, натрий, калий, магнезий, урея азот, пренасищане (SS) CaOx, SSUA, SSCaP. Химията на урината се извършва от Litholink Corporation. Титрируемата екскреция на киселина се изчислява от рН на урината, фосфор и креатинин, както е описано от Lennon et al. (1966). Изчислена е GI алкална абсорбция: (Na + K + Ca + Mg) - (Cl + 1.8P) (Oh 1989).

Уестърн блотинг

Трансплантирани фекални мишки и контролни мишки, които не отговарят на възрастта, бяха евтаназирани в CO2 камера (за да се постигне ефект) в края на експеримента (4-седмична времева точка). Бъбреците и тънките и дебелите черва бяха събрани, поставени в студена 1XPBS и отстранени съединителни тъкани. Сегменти от илеума (

Статистически анализ

променя

Не е имало разлика в наддаването на тегло между 4-седмичната група на FT (n = 9) и 4-седмичната контролна група, съответстваща на микроби (n = 9), съответно (Фиг. 2). В допълнение, 24-часовият креатинин в урината (Cr) остава на сходни нива по време на експеримента, без статистически разлики между изходното ниво и на 4 седмици след FT (1,42 ± 0,06 mg/ден и 1,39 ± 0,12 mg/ден, съответно; P = 0,31). След това всички 24-часови уринарни параметри бяха съответно коригирани за 24-часов креатинин (Фиг. 3).

Телесно тегло на мишки без микроби на изходно ниво и на 4 седмици след получаване на фекална трансплантация. Животните както в контролните (CTR), така и в фекалните трансплантирани групи (FT) са натрупали значително тегло през 4-те седмици на експеримента в сравнение с изходните стойности. Увеличаването на телесното тегло не се различава при CTR и FT без микробни мишки. Данните съответстват на средната стойност ± SEM; n = 9 на група; T-тест на студент: ** P 3 A и B). Тези промени се наблюдават още 1 седмица след FT и остават стабилни за 4-седмичната продължителност на проучването. Както е показано на Фигура 3 А, Ca в урината намалява след FT, за да достигне стойности, които са били средно с 55% по-ниски на 4 седмици след FT от тези, измерени на изходно ниво (P 3 B). Повторният анализ на измерванията също не показва разлики в уринарния вол между 2 и 3 седмици (P = 0,62), 2 и 4 седмици (P = 0,94) и 3 и 4 седмици (P = 0,96) след FT. Пренасищането (SS) на CaOx е спаднало с 68% на 4 седмици след трансплантацията (експресията на протеини P 4, A6 в бъбреците, сляпото черво и дебелото черво са били значително и диференцирано повлияни от GMB. Във връзка с 24% намаление на Ox в урината наблюдавани на 4 седмици след FT, нивата на A6 в бъбреците (където той участва в проксималната тубулна секреция на Ox) са с 40,25% по-ниски от тези в контролите (P = 0,013). Не се наблюдава значителна разлика в експресията в илеума, докато cecal A6 се е увеличил с 1,9 пъти (P = 0,0005), а дебелото черво A6 е намаляло с 38,50% (P = 0,005) (фиг. 4 A) .Защото сме наясно, че OF може да повлияе на експресията на A6 (Hatch et al (2006 г.), проведохме фокусиран анализ на видово ниво и не идентифицирахме OF, но разбираме, че с добавянето на метагеномика OF се идентифицира по-често, но все още в много малко изобилие.

Промените в химията на урината, наблюдавани при мишки без микроби след фекална трансплантация (фиг. 3), са широко признати като важни детерминанти на риска от камъни в урината (Sakhaee et al. 2012; Cheungpasitporn et al. 2016). Наблюдаваното значително намаляване на калция и оксалата в урината, наблюдавано на 4 седмици след трансплантацията, предполага, че GMB може да повлияе на баланса на CaOx. Като се има предвид сегашното мнение, че колонизацията на OF може да бъде неразделна част от метаболизма на GMB на оксалат, ние се заинтригувахме, че фекалната трансплантация от стандартно здраво животно без идентифицирани OF на 16S секвениране, значително понижи уринарния оксалат, налагайки 3,6-кратно намаляване на супер наситеността на CaOx. Няколко стандартни организми в общността обаче са свързани с уринарния оксалат. Ние, както и други (Suryavanshi et al. 2016) установихме, че родът Sutterella е в отрицателна корелация с оксалат. Семейство Clostridiaceae съдържа много родове, за които е известно, че са активни оксалатни разградители (Miller et al. 2014) и също така е в отрицателна корелация с уринарния оксалат на 4 седмици.

Като се има предвид, че абсорбцията на алкали в червата е установен и важен физиологичен процес (Tang et al. 2015), изглежда вероятно микробиомът да повлияе на баланса му. Изчислената GI алкална абсорбция значително се увеличава на 4 седмици след FT. Действителната роля на GMB за увеличаване на алкалите в този модел е неясна, но със сигурност провокативна. Независимо от това, GMB, чрез производството на мастни киселини с къса верига или други секреторни функции, е от ключово значение за поддържането на лигавичната бариера на червата (Corfield 2018). Известно е също, че чревната микробиота участва в метаболизма на пурините. Забележителен интерес е, че Clostridia е доказано, че е способна на метаболизма на пикочната киселина и е в състояние да използва пурини като единствен източник на въглерод, азот и енергия (Durre and Andreesen 1982; Hartwich et al. 2012). Корелационният анализ показа, че родът Clostridium е в обратна корелация с амония в урината и пикочната киселина в урината на 4 седмици след FT.

Нарастващото разпространение на бъбречните камъни (Litwin и Saigal 2012) и високата честота на рецидиви на камъни (Scales et al. 2012; Tasian et al. 2016), въпреки диетичното консултиране и фармакологичната намеса, мотивира изследванията за идентифициране на нови парадигми за лечение на камъни в бъбреците пациенти. Диетата се счита за основен фактор, допринасящ за щатския долар (Pak 1998; Borghi et al. 2002; Taylor et al. 2004; Tracy et al. 2014), но механизмите, лежащи в основата на връзката между диетата и щатския долар, са слабо разбрани. Вероятно е, че GMB влияе върху метаболизма, задвижван от диетата и като такъв е свързан с няколко медицински състояния, включително камъни в бъбреците (Hesse et al. 1999; Hatch et al. 2006; Barnett et al. 2016; Stern et al. 2016). Има доказателства, че USD, подобно на DM и затлъстяването, може да бъде свързан с уникален GMB профил (Turnbaugh et al. 2006; Larsen et al. 2010; Stern et al. 2016). Освен това, знаейки, че както DM, така и затлъстяването могат да бъдат повлияни с фекална трансплантация, съчетано с индикации от нашите данни, че трансферът на GMB променя химията на урината, дава допълнителна обосновка за продължаване на научаването как да се манипулира микробиома за намаляване на риска в щатски долари.

Конфликт на интереси

Бележки

Stern JM, Urban-Maldonado M., Usyk M., Granja I., Schoenfeld D., Davies KP, Agalliu I., Asplin J., Burk R., Suadicani SO. . Physiol Rep, 7 (4), 2019, e14012, 10.14814/phy2.14012 [CrossRef] [Google Scholar]

Информация за финансиране

NIH R21 DK108097‐02 Награда за кариерно развитие на Американското общество по нефрология.