Редактирано от Лорънс Стайнман, Медицинско училище в Станфорд, Станфорд, Калифорния, и одобрено на 9 април 2019 г. (получено за преглед на 14 декември 2018 г.)

експресията

Значимост

Клетъчно-специфичната и специфична за региона генна експресия може да идентифицира терапевтични цели в различни невроанатомични региони по време на невродегенеративни заболявания. Множествената склероза (МС) е мултифокална и са необходими невропротективни лечения. Тук RNA секвенирането на мозъка на MS предлага изследване на транскриптома на олигодендроцитни клетки (OLC) на място, където се появява ремиелинизация в модел на MS. Пътищата за синтез на холестерол доминират като най-високо регулирани пътища в OLCs на corpus callosum по време на ремиелинизация в модела на купризон. Лечението с естроген рецептор-β лиганд допълнително увеличава пътищата на синтез на холестерол чрез директни ефекти върху OLC. Тъй като феталните OLC са изложени вътреутробно на високи нива на естрогени в майчината кръв, ние предполагаме, че ремиелинизиращите свойства на лечението с естроген при възрастни по време на нараняване могат да рекапитулират нормалната миелинизация в развитието чрез насочване към хомеостазата на холестерола.

Резюме

Множествената склероза (МС) е автоимунно заболяване на ЦНС, характеризиращо се с възпаление, демиелинизация и увреждане на аксоните, с минимална ремиелинизация (1). Настоящите имуномодулаторни лечения за МС са ефективни за намаляване на рецидивите, но не възстановяват уврежданията. Необходими са невропротективни лечения, насочени към клетките на ЦНС за подобряване на уврежданията, може би чрез увеличаване на ремиелинизацията (2).

Недостатъчната ремиелинизация при МС е свързана отчасти с неспособността на олигодендроцитните прекурсорни клетки (OPC) да се диференцират в зрели миелинизиращи олигодендроцити (3, 4). Смята се, че това е резултат от враждебна микросреда на ЦНС, която инхибира OPC диференциацията, като провъзпалителни цитокини и хемокини (5, 6), богат на левцин повторен и имуноглобиноподобен домен-съдържащ протеин 1 (LINGO1) (7) и хондроитин сулфат протеогликани (CSPG) (8). Стратегиите за ремиелинизация вероятно ще изискват модулация на външни фактори, свързани с възпалението на ЦНС, както и насочване към вътрешни фактори, свързани със съзряването на олигодендроцитите и миелинизацията (2), и един без друг може да не е достатъчен (9). Освен това, този подход трябва да бъде ефективен при възрастни ЦНС в условията на аксонално увреждане, за да бъде ефикасен при пациенти с МС.

Молекулярните механизми, присъщи на олигодендроцитите по време на ремиелинизация in vivo, използвайки модел на хронична демиелинизация с увреждане на аксоните, могат да разкрият терапевтични цели за улесняване на ремиелинизацията при МС. Изследването на олигодендроцитите чрез едноклетъчни и генетично инженерни стратегии за обогатяване, последвано от високопроизводително секвениране и биоинформатични анализи, даде ценна информация за това как OPCs се регулират по време на миелинизацията в развитието (10, 11), както и кога OPCs от възрастни се активират от демиелинизация (10). Това, което остава неизвестно, е олигодендроцитният транскриптом по време на ремиелинизация in vivo в бяло вещество на възрастни в условията на увреждане на аксоните. Това би предоставило директна информация за идентифицирането на терапевтични цели, за да се улесни ремиелинизацията при МС.

Тук използвахме технологията RiboTag за определяне на специфична за олигодендроцитите родова клетка (OLC) генна експресия in vivo в corpus callosum по време на ремиелинизация в хроничен модел на купризон, характеризиращ се със значително увреждане на аксоните. Технологията RiboTag включва Cre-LoxP рекомбинация за генериране на трансгенни мишки, експресиращи маркирани с HA HA рибозоми в специфични клетъчни типове (12 ⇓ –14). Мишките Olig1-RiboTag позволяват изолирането на специфични за OLC транскрипти от целеви региони в мозъка на възрастни мишки. Когато се използват в модели на MS, последващото секвениране на РНК и анализи могат да разкрият присъщи механизми в OLC по време на ремиелинизация in vivo в ЦНС при възрастни по време на нараняване. Този подход на RiboTag е използван тук за откриване на пътища на генна експресия, присъщи на олигодендроцитите по време на ремиелинизация в хроничния модел на купризон и експериментален автоимунен енцефаломиелит (EAE).

Резултати

РНК секвениране в мозъчните региони на MS.

Ремиелинизация след хронична демиелинизация в модела на нараняване, причинено от диетата на Cuprizone.

Специфични за олигодендроцитите транслатомни промени по време на ремиелинизация след хронична демиелинизация. Мишките Olig1-RiboTag бяха използвани за сравняване на специфичната за олигодендроцитите генна експресия в corpus callosum по време на фазата на ремиелинизация при мишки, хранени с купризон за 9 седмици, последвана от нормална диета за 3 седмици (група 9w + 3w) спрямо фазата на демиелинизация при мишки, хранени с диета с купризон за 9 седмици (група 9w). (А) Топ 10 регулирани нагоре и надолу регулирани канонични пътища от диференциално експресирани гени на олигодендроцити по време на ремиелинизация (група 9w + 3w). Червената звездичка показва пътищата на синтез на холестерол като четирите най-регулирани пътища по време на ремиелинизация. (B) Топлинната карта показва регулиране нагоре (червено) на множество гени на пътя на синтеза на холестерол по време на ремиелинизация.

За да потвърдим регулираната нагоре експресия на холестерол-синтетични гени по време на ремиелинизация, ние извършихме qPCR на OLC-специфични РНК, изолирани от корпус калозум на различен набор от мишки Olig1-RiboTag. Както е илюстрирано на фиг. 5А, ние изследвахме три гена за синтез на холестерол, кодиращи важни ензими в синтеза на холестерол, а именно 3-хидрокси-3-метилглутарил-КоА синтаза1 (Hmgcs1), фарнезил дифосфат синтаза (Fdps) и фарнезил-дифосфат фарнезилтрансфераза 1 (Fdft1). Установихме, че 9w + 3w мишки по време на фазата на ремиелинизация значително са увеличили нивата на експресия на гена Hmgcs1, Fdps и Fdft1 (Фиг. 5В). След това показахме повишена експресия на Hmgcs1, Fdps и Fdft1 на ниво протеин чрез извършване на имунофлуоресценция върху тъкани, получени от WT мишки. Двойното имуномаркиране за HMGCS1, FDPS или FDFT1 с олигодендроцитния маркер CC1 показва значително увеличение на експресията на протеин за синтез на холестерол в CC1 + олигодендроцити в корпуса на мишките 9w + 3w по време на фазата на ремиелинизация (фиг. 5 C – E и SI приложение, Фиг. S4). Заедно тези резултати показват, че олигодендроцитите регулират нагоре генните пътища на синтеза на холестерол по време на ремиелинизация след хронична демиелинизация с аксонално увреждане.

Първо, ние оценихме дебелината на миелиновата обвивка в гръбначния мозък от EAE мишки, използвайки EM, за да покажем степента на ремиелинизация, индуцирана от лечение с ERβ-лиганд (Фиг. 6А). EAE мишки, лекувани с ERβ лиганд, показват увеличаване на дебелината на миелина и намаляване на g-съотношението (диаметър на аксона, разделен на миелин плюс диаметър на аксона) в сравнение с контролите на носителя (фиг. 6 А и С), потвърждавайки ремиелинизиращия ефект на лечението с ERβ-лиганд по време на EAE (9, 16 ⇓ –18). За по-нататъшно разграничаване между по-малко демиелинизиране и повече ремиелинизация по време на лечението с ERβ-лиганд при EAE, използвахме мишки Cspg4-CreERT2/Mapt-GFP, които позволяват визуализиране на новообразувания миелин чрез експресия на GFP (2). При лечение с ERβ-лиганд на EAE се наблюдава повишаване на GFP-позитивния миелин (Фиг. 6 B, D и E).

След това изследвахме дали лечението с ERβ-лиганд има пряко въздействие върху зрелите олигодендроцити. Докато лечението с ERβ-лиганд значително увеличава процента на GSTπ + и CC1 + клетки при 9w + 3w/ERβ WT мишки в сравнение с 9w + 3w/Veh WT мишки, този защитен ефект не е налице при 9w + 3w/ERβ CKO мишки в сравнение с 9w + 3w/Veh CKO мишки (фиг. 8 B, C, F и G). След това определихме дали лечението с ERβ-лиганд има пряко въздействие върху OPC. Докато третирането с ERβ-лиганд увеличава процента на NG2 + OPC при 9w + 3w/ERβ WT мишки в сравнение с третирането на носител при 9w + 3w/Veh WT мишки, този ефект не е налице при 9w + 3w CKO мишки (Фиг. 8 D и Н). По този начин лечението с ERβ-лиганд има директни ефекти върху OLCs по време на ремиелинизация в модела на хроничния купризон.

И накрая, определихме дали лечението с ERβ-лиганд модулира микрогилия и астроцитна реактивност в модела на хроничния купризон чрез оценка на активирането на Iba1 + микроглия и GFAP + астроцити чрез двойно имуномаркиране с MHCII. Наблюдавахме значително увеличение на процента на MHCII-експресираща микроглия и астроцити при 9w мишки в сравнение с нормалните контроли и значително намаляване по време на ремиелинизация при 9w + 3w мишки, но няма ефект от ERβ-лиганда спрямо лечение с носител (SI Приложение, Фиг. S7).

Подобрената ремиелинизация в модела за хроничен купризон се характеризира с по-нататъшно регулиране на пътищата на синтеза на холестерол в OLC с лечение с ERβ-лиганд.

ERβ-свързващи профили за човешки FDPS и ChIP анализ за миши Fdps ген. (A) ChIP-seq данни за доксициклин-индуцируеми ERβ-експресиращи човешки MDA-MB-231 клетки, третирани с естрадиол, са получени от базата данни GEO (номер за присъединяване GSE108981). Пиковете в ERβ ChIP профилите показват ERβ свързване в региона. FDPS показва пикове около първите екзони в ERβ ChIP профила, докато отрицателният контролен входен профил (ДНК от хроматин преди ChIP) не показва пика. Като допълнителна отрицателна контрола, генът PKLR, близо до гена FDPS, няма пик. (B) ERβ се свързва с предполагаемата ERE на гена Fdps на мишка. ChIP с използване на нормален миши IgG и анти-ERβ се извършва за хроматин, изолиран от миши N20.1 олигодендроцитни клетъчни линии (21), третирани с ERβ лиганд (DPN). В региона са проектирани два комплекта праймери, съдържащи предполагаеми ERE на гена Fdps (51).

Дискусия

Тук ние приложихме технологията RiboTag за изследване на молекулярните механизми в олигодендроцитите in vivo по време на ремиелинизация при възрастни мишки, използвайки два допълващи се модела на хронична демиелинизация с аксонална дегенерация. Установихме, че регулацията на холестероловите пътища на синтез доминира в профила на транскриптома на OLC по време на ремиелинизация при възрастни след нараняване.

Високопроизводителните in vitro екрани на библиотеки с малки молекули могат да идентифицират нови кандидати за тест за индукция на ремиелинизация in vivo (2, 4, 45). Нашите открития показват, че техният клетъчно-специфичен и специфичен за региона механизъм на действие in vivo трябва да бъде изследван изчерпателно. Например, наскоро ин витро скрининг с висока производителност идентифицира молекули, насочени към ензими в рамките на пътя на синтеза на холестерола (46). Разбирането към кои типове клетки на ЦНС са насочени, към кои региони на ЦНС in vivo по време на лечението с тези съединения ще е необходимо, за да се разбере механизмът и да се приведе в съответствие с изходните мерки в клиничните изпитвания, ако ефикасността в крайна сметка трябва да бъде доказана в МС (12). В идеалния случай, високопроизводителният in vitro скрининг на съединения трябва да бъде последван от in vivo специфична за клетките и региона специфична генна експресия за механизъм.

В заключение, тази работа разкрива значението на използването на специфичен за клетките подход на генна експресия в ЦНС по време на сложни невродегенеративни заболявания, което води до прозрения в хомеостазата на холестерола в олигодендроцитите по време на ремиелинизация в условията на аксонално увреждане.

Материали и методи

Високопроизводителен РНК-секвениращ анализ на тъкани от МС.

Проби от прясно замразена аутопсия на мозъчна тъкан от пет пациенти с MS (средна възраст 57,6 години) и пет здрави контроли, отговарящи на възрастта (средна възраст 56,2 години) са получени от Центъра за изследване на човешкия мозък и гръбначния флуид (Лос Анджелис, Калифорния) ). Регионите включват корпус калозум, хиазма на зрителния нерв, вътрешна капсула, хипокампус, фронтална кора и теменна кора. Секвенирането беше извършено на Illumina HiSeq3000 за еднократно изпълнение 1 × 50. За да се изчисли диференцирано изразеният брой на гените в различни типове клетки на ЦНС, списъци с топ 500 обогатени гена в седем типа клетки на ЦНС (неврон, микроглия, астроцити, ендотели, OPC, новообразуван олигодендроцит и миелинизиращ олигодендроцит) от базата данни за транскриптома на РНК-секвениране (11) са използвани като референтен списък с гени (SI приложение, допълнителни материали и методи).

Животни.

Мишките бяха възрастни жени (на възраст 8–12 седмици) на фон C57BL/6. B6; 129S4-Olig1tm1 (cre) Rth/J (Olig1-Cre) мишки и B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J (RiboTag) мишки (14, 19) бяха кръстосани за получаване на хомозиготни мишки от Olig1-cre и RiboTag. За да се получат мишки Olig1-CKO, C57BL/6J-ERβ флоксирани/флоксирани мишки (9) бяха кръстосани с B6; 129S4-Olig1tm1 (cre) Rth/J (Olig1-cre). За да се получат мишки Cspg4-CreERT2/Mapt-GFP, B6.Cg-Tg (Cspg4-cre/Esr1 *) BAkik/J бяха кръстосани с мишки B6; 129P2-Mapt/J (2). Всички процедури бяха извършени в съответствие с насоките на Комитета за изследване на животните на Канцлера на Калифорнийския университет, Лос Анджелис, Служба за защита на изследователските субекти (Приложение SI, допълнителни материали и методи).

Модел на Cuprizone.

Женските мишки (на възраст 8-10 седмици) са били на диета купризон в продължение на 6 седмици или 9 седмици, за да предизвикат демиелинизация, последвано от 3 седмици нормална диета. Лечението с ERβ лиганд (9) беше по време на фазата на нормална диета (SI Приложение, Допълнителни материали и методи).

EAE модел.

Активно EAE се индуцира с аминокиселини 35–55 на миелин олигодендроцитен гликопротеин (12). Лечението с ERβ-лиганд е започнато 1 седмица преди EAE индукцията и се прилага през ден (9). За трансгенни мишки Cspg4-CreERT2/Mapt-GFP, тамоксифен (Sigma-Aldrich) се разтваря в царевично масло (75 mg/kg) и се прилага s.c. 2 седмици преди лечение с ERβ-лиганд в продължение на пет последователни дни (приложение SI, допълнителни материали и методи).

Високопроизводително РНК секвениране на олигодендроцити по време на ремиелинизация.

Corpus callosum-олигодендроцит-специфични РНК от нормални мишки или тези, които получават диета купризон за 9 седмици (група 9w) или за 9 седмици, последвана от нормална диета за 3 седмици (група 9w + 3w) са изолирани от тъканите на мишките Olig1-RiboTag. Секвенирането беше извършено на Illumina HiSeq3000 за еднократно изпълнение 1 × 50. Анализът за обогатяване на каноничния път е извършен за диференциално експресирани гени във всяка тъкан, като се използва анализ на интензивността на пътя (Qiagen), както е описано по-горе (12) (SI Приложение, Допълнителни материали и методи).

Приложени са стандартни qPCR методи, както е описано по-горе (9). Списъците на грундовете са дадени в допълнение SI, таблица S5 (приложение SI, допълнителни материали и методи).

Хистологичен анализ.

Приложени са стандартни методи за хистологичен анализ, както е описано по-горе (9). Подробни методи са дадени в допълнение SI, допълнителни материали и методи. Списък на антитела за имунофлуоресцентно оцветяване е предоставен в приложение SI, таблица S6.

ERβ ChIP-Seq профили за гени за синтез на холестерол.

ChIP-seq данни за доксициклин-индуцируеми ERβ-експресиращи човешки MDA-MB-231 клетки, третирани с естрадиол, са получени от базата данни GEO (номер за присъединяване GSE108981) (47). За привеждане в съответствие с човешкия геном (hg19) е използван R пакет “QuasR” (48), а ERβ-свързващите профили са генерирани с вход от R пакети “GenomicFeatures” (49) и “Gviz” (50). Профилите за ERβ ChIP бяха анализирани за гени на холестерол (SI Приложение, Допълнителни материали и методи).

ChIP анализ за оценка на свързването на ERβ с ERE на Fdps.

Обезсмъртената миши N20.1 олигодендроцитна клетъчна линия (21) беше третирана с ERβ лиганд. ChIP се извършва чрез използване на EZ-Magna ChIP A/G (Millipore) с ERβ/NR3A2 антитяло (Novus Biologicals). Имунопреципитираните ДНК около предполагаемата ERE на гена Fdps (51) са амплифицирани чрез PCR (SI приложение, допълнителни материали и методи).

Наличност на данни.

Наборите от данни, генерирани по време на това проучване, са налични в базата данни GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) под следните номера за присъединяване: GSE123496, жени с МС и здрави контроли, съобразени с възрастта (хипокампус, фронтален кора, вътрешна капсула, корпус калозум и теменна кора) (52); GSE100297, MS и контрол (оптичен хиазъм) (53); и GSE118451, Oligo1 RiboTag данни при мишки с купризон (54). Допълнителни подробности за методите и статистиката са предоставени в допълнение SI, допълнителни материали и методи.

Благодарности

Благодарим на Рой Ким, Дариан Мангу, Юнис Юнг, Раул Алехандро-Рамирес, Кевин Ерера и Александрия С. Хофман за техническата помощ. Тази работа беше подкрепена от NIH Grants R01NS096748 и R01NS109670 (към RRV), Conrad N. Hilton Foundation Grants 20130231 и 20150232 (към RRV), Фондация "Том Шерак MS Hope", Фондация "Rhoda Goetz" за МС, Фондът на еврейската общност и Фондация „Дънк МС“. Образци от човешка тъкан са получени от Ресурсния център за човешки мозък и гръбначни течности, Център за здравеопазване в Западен Лос Анджелис, който е спонсориран от NIH, Националното общество за множествена склероза и Американското министерство на ветераните.

Бележки под линия

  • ↵ 1 До кого трябва да се адресира кореспонденция. Имейл: rvoskuhlmednet.ucla.edu .