C. J. O'Shea

1 Училище по земеделие и хранителни науки, Колеж по науки за живота, Университетски колеж Дъблин, Белфийлд, Дъблин 4, Република Ирландия

J. V. O'Doherty

1 Училище по земеделие и хранителни науки, Колеж по науки за живота, Университетски колеж Дъблин, Белфийлд, Дъблин 4, Република Ирландия

J. J. Callanan

2 Училище по ветеринарна медицина, Колеж по науки за живота, Университетски колеж Дъблин, Белфийлд, Дъблин 4, Република Ирландия

Д. Дойл

1 Училище по земеделие и хранителни науки, Колеж по науки за живота, Университетски колеж Дъблин, Белфийлд, Дъблин 4, Република Ирландия

К. Торнтън

2 Училище по ветеринарна медицина, Колеж по науки за живота, Университетски колеж Дъблин, Белфийлд, Дъблин 4, Република Ирландия

Т. Суини

2 Училище по ветеринарна медицина, Колеж по науки за живота, Университетски колеж Дъблин, Белфийлд, Дъблин 4, Република Ирландия

Резюме

Водораслите полизахариди ламинарин (LAM) и фукоидан (FUC) имат мощни противовъзпалителни действия в стомашно-чревния тракт. Нашата цел беше да изследваме въздействието на предишната консумация на LAM и/или FUC върху патологията и възпалението след предизвикателство с декстран натриев сулфат (DSS) при свинете. Прасета (n 7/група) са разпределени в една от петте експериментални групи за 56 d. От 49–55 дни дестилирана вода или DSS се прилага интрагастрално. Експерименталните групи бяха: (1) базална диета + дестилирана вода (контрол); (2) базална диета + DSS (DSS); (3) базална диета + FUC + DSS (FUC + DSS); (4) базална диета + LAM + DSS (LAM + DSS); и (5) базална диета + LAM + FUC + DSS (LAMFUC + DSS). Групата DSS е намалила наддаването на телесно тегло (P Ключови думи: Ламинарин, Фукоидан, улцерозен колит, декстран натриев сулфат, прасета, цитокини, ентеробактерии

Материали и методи

Всички експериментални процедури, описани в това проучване, са проведени под експериментален лиценз от Министерството на здравеопазването на Ирландия в съответствие със Закона за жестокостта към животните от 1876 г. и Регламентите на Европейските общности (Изменения на Закона за жестокостта към животните от 1876 г.) (1994).

Експериментален дизайн и диетичен състав

Животни и управление

Общо тридесет и пет прасета (потомство на големи бели × (Големи бели × Landrace) свине) с тегло 7 (sd 0 53) кг бяха разпределени в една от петте експериментални групи (n 7 прасета/експериментална група) и бяха настанени индивидуално в писалки (1 · 7 × 1 · 2 м). Храната и водата се осигуряват ad libitum. Прасетата се претеглят в началото на експеримента (ден 0), в началото на дозирането на DSS (ден 49) и деня на евтаназията (ден 56), за да се получи телесно тегло и да се изчисли средната дневна промяна в телесното тегло.

Резултат от диария

Всички прасета са наблюдавани индивидуално за клинични признаци на диария от 49-ия ден до 56-ия ден от експеримента от един оператор, без предварително познаване на експериментални групи. Приложена е система за оценяване, за да се посочи наличието и степента на тежест (, 19). Използвана е следната система за оценяване: 1 = твърди твърди изпражнения; 2 = леко меки изпражнения; 3 = меки, частично оформени фекалии; 4 = хлабави, полутечни изпражнения (диария); и 5 = воднисти, слузести фекалии (тежка диария).

Композиционен анализ на фураж и екстракт от морски водорасли

Ксилоза на серума, хистопатологичен анализ на тънките черва и дебелото черво

полизахариди

Представителни участъци от проксимално дебело черво, оцветени с хематоксилин и еозин (увеличение × 10), демонстриращи спектрите на патологията. (а) здрава тъкан, (б) здрава с намален инфилтрат на проприални клетъчни пластини, (в), фокална улцерация, граничеща с непокътнат епител, (г) дифузна язва. Показаната хистология е представителна за изследваните тъкани на дебелото черво във всичките пет групи прасенца (n 7 на група).

Проксимална експресия на гена на дебелото черво

Микробиология

Микробната геномна ДНК беше извлечена от проксималната дигеста на дебелото черво с помощта на комплект за изпражнения на QIAamp ДНК (Qiagen) в съответствие с инструкциите на производителя. Количеството и качеството на ДНК бяха оценени с помощта на Nanodrop (Thermo Scientific). Стандартните криви бяха изготвени от обединени аликвотни части на микробна ДНК на дигеста и бяха използвани за оценка на абсолютния брой на Enterobacteriaceae на дебелото черво въз основа на броя на генните копия (, 27) За количествения PCR анализ в реално време са използвани олигонуклеотидни праймери, специфични за гена на Enterobacteriaceae 16 s rRNA (преден праймер 5′ − 3 ′ CATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGC и обратен праймер 5′ − 3 ′ CTCTACGAGACTCAAGCTTGC) (, 28). PCR в реално време, използвайки ABI 7500 PCR система в реално време (Applied Biosystems) беше извършена в краен реакционен обем от 20 µl, съдържащ 1 µl матрична ДНК, 1 µl праймери и обратни праймери (100 pm), 10 µl SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) и 8 µl вода без нуклеаза. Условията на термичното циклиране включват начален етап на денатурация при 95 ° C за 10 минути, последван от четиридесет цикъла от 95 ° C за 15 s и 65 ° C за 1 min. Анализите на кривата на дисоциация на PCR продукта потвърждават специфичността на анализа. За изчисления са използвани средните стойности на праговия цикъл от три повторения на всяка проба.

Статистически анализ

LAMFUC, ламинарин + фукоидан; NS, P ≥ 0.05.

* P † Предварително планирани контрасти със стойност P за сравнение: контраст 1 = DSS v. Контрол; контраст 2 = FUC + DSS срещу DSS; контраст 3 = LAM + DSS срещу DSS; контраст 4 = LAMFUC + DSS срещу DSS.

LAMFUC, ламинарин + фукоидан; NS, P ≥ 0.05.

* P † Предварително планирани контрасти със стойност P за сравнение: контраст 1 = DSS v. Контрол; контраст 2 = FUC + DSS срещу DSS; контраст 3 = LAM + DSS срещу DSS; контраст 4 = LAMFUC + DSS срещу DSS.

Enterobacteriaceae в проксималната дигеста на дебелото черво

В проксималното дебело черво, DSS групата е увеличила броя на копията на 16 s rRNA гена на Enterobacteriaceae (P Таблица 2). Групата LAM + DSS е намалила ентеробактериите (P Таблица 3. Крайното телесно тегло (ден 56) е отрицателно свързано с проксималния резултат от патологията на дебелото черво (r −0 · 58; P † ‡

Проксимална експресия на гена на дебелото черво на избрани възпалителни маркери Патологичен резултатIL-8IL-6IL-1βIL-17ATGF-βTNF-αIL-10 Проксимално дебело черво Дистално дебело черво
Крайно телесно тегло−0 · 18−0 · 48 *−0 · 52 **−0 · 39 *−0 · 19−0 · 43 *−0 · 15−0 · 58 ***−0 · 43 *
Наддаване на телесно тегло−0 · 23−0 · 62 ***−0 · 49 *−0 · 34−0 · 27−0 · 29−0 · 15−0 · 75 ***−0 · 74 ***
Резултат по патология (проксимално дебело черво)0 · 41 *0 · 86 ***0 · 58 ***0 · 38 *0 · 48 **0 · 56 **0 · 52 ** 0 · 77 ***

Значими коефициенти на корелация: * P † Коефициентите на ранг на корелация на Spearman са използвани за определяне на статистическа зависимост между оценката на патологията и други променливи, а корелациите на Pearson за връзките между телесното тегло и данните за цитокините.

Дискусия

В настоящото проучване, при DSS предизвикателна ситуация, прасетата са имали нарушено наддаване на телесно тегло и диария. Това беше придружено от хистопатологични доказателства за UC в проксималното дебело черво, повишаване на експресията на провъзпалителния цитокинен ген и увеличаване на луминалното изобилие на Enterobacteriaceae. Преди това е доказано, че водорасловите полизахариди LAM и FUC проявяват противовъзпалителна активност, а също и инхибиращи ефекти върху Enterobacteriaceae (, 11, 12, 30) и са изследвани тук за потенциална роля за облекчаване на ефектите от предизвикателния период на DSS при прасета. Предварителната консумация на FUC и/или LAM подобри резултата от диария, свързан с DSS предизвикателство, което показва защитен ефект. Тези ефекти са придружени от намаляване на генната експресия на изоинфламаторния цитокин IL-6 mRNA в изобилието в проксималната тъкан на дебелото черво. Освен това, предварителната консумация само на LAM намалява изобилието на Enterobacteriaceae в проксималното дебело черво, свързано с DSS предизвикателство.

Развитието на UC често се свързва със загуба на тегло, поради комбинация от неадекватност, малабсорбция на хранителни вещества и загуба на течности и електролити чрез диария (, 3, 31). Крайното телесно тегло на DSS групата е приблизително 11% по-малко от това на контролната група в края на експеримента, отразявайки намаляване на нарастването на телесното тегло с 30% през 7 d периода на администриране на DSS. Предишни проучвания показват, че диетичното включване на екстракт от морски водорасли, съдържащ LAM и FUC, може да подобри наддаването на телесно тегло при новоотбити прасенца, които често претърпяват преходно възпаление на дебелото черво поради стреса от диетичните промени (, 13, 14). Настоящите резултати показват, че групата LAMFUC + DSS е имала по-голямо окончателно телесно тегло в края на експеримента спрямо групата DSS, което показва облекчаване на загубата на тегло, свързано с предизвикателство DSS. Въпреки това, докато групата FUC + DSS е подобрила наддаването на тегло, нито тази група, нито групата LAM + DSS се различават от групата DSS, което предполага, че полизахаридните екстракти от водорасли са по-ефективни в комбинация за запазване на телесното тегло.

Докато диарията е важен компонент на вродената имунна система, като улеснява изчистването на патогена от епитела на дебелото черво (, 32, 33), тя има ограничена стойност в UC, като служи за отслабване на гостоприемника чрез изчерпване на течности и електролити. В това проучване групата DSS разви диария след прилагане на DSS в продължение на 7 дни. Интересното е, че експерименталните групи, съдържащи LAM и FUC, едновременно и колективно намаляват тежестта на диарията, свързана с DSS предизвикателство. От тях групата FUC + DSS показва най-голямото подобрение на диарията спрямо групата DSS. В по-ранно проучване Zhang et al. (, 34) показа, че интравенозното приложение на FUC подобрява увреждането на лигавицата при миши модел на колит. Ролята на тези екстракти от морски водорасли, и по-специално FUC, за облекчаване на диарията заслужава по-нататъшно проучване, като се има предвид приносът на постоянната диария към здравословното бреме на пациентите с UC .

При UC патологията обикновено се появява между илеоцекалната клапа и ректума. Възможно е обаче да има някакво засягане на дисталния илеум и такъв илеит води до ерозия на лигавицата и закърнели власинки (, 36), допринасяйки за малабсорбция на хранителни вещества и загуба на тегло (, 3, 37). В това проучване няма данни за дистрофия на вили, наблюдавани в илеума на DSS групата спрямо контролната група; обаче серумните концентрации на ксилоза на първите са по-ниски в сравнение с вторите, което предполага известна степен на малабсорбция на ксилоза в тънките черва (, 38). Следователно, въпреки че DSS-индуцираното възпаление е локализирано в дебелото черво, функцията на илеума може да е била нарушена поради умерено влошаване от DSS (, 39). Наскоро показахме, че екстрактите от морски водорасли, богати на LAM и FUC, подобряват смилаемостта на хранителните вещества при прасетата, подложени на стрес при отбиване (, 13), вероятно поради регулиране на гените, участващи в транспорта на монозахариди (, ​​40). В настоящото проучване обаче серумните концентрации на ксилоза при всички DSS групи, получаващи екстракти от морски водорасли, са по-високи, но не и различни между контролните и DSS групите.

Ролята на чревната микробиота привлече много внимание поради присъщите различия в различните бактериални таксономични слоеве в профила на пациентите с UC в сравнение с този на здрави тестови субекти (, 49). Например, има повече доказателства за повишено изобилие на Грам-отрицателни бактерии при пациенти, които се представят с UC в някои проучвания (, 50), включително Enterobacteriaceae, които са свързани със тежестта на заболяването (, 51). В настоящото проучване DSS групата е имала 1 кратно увеличение на Enterobacteriaceae в проксималното дебело черво спрямо контролната група, успоредно на връзката на Enterobacteriaceae с UC, наблюдавано при клинични изследвания. По-рано беше показано, че LAM и FUC могат да модифицират профила на чревната микробиота, включително намаляване на изобилието от Enterobacteriaceae в дигеста на дебелото черво на свинете (, 8, 20). Групата LAM + DSS е имала намалено изобилие от Enterobacteriaceae спрямо групата DSS, което е на ниво, сравнимо с контролната група. Значението на този ефект в контекста на това как LAM смекчава други измерени променливи, свързани с предизвикателство за DSS в настоящото проучване, не е ясно, но може да бъде важно, като се има предвид загрижеността за ролята на Enterobacteriaceae при възпалително чревно заболяване.

В обобщение, предизвикателство за DSS при прасето е свързано с намалено телесно тегло, диария и повишаване на провъзпалителния цитокин IL-6, както и с изобилието на Enterobacteriaceae в дигеста на дебелото черво. Констатациите от това проучване показват, че предишното излагане на диети, съдържащи FUC и комбинация от FUC и LAM заедно, подобрява загубата на тегло, диарията, но не успява да подобри оценката на патологията, свързана с DSS предизвикателство в проксималното дебело черво на прасетата. Наблюдава се силна корелация между изобилието на IL-6 на мукозната иРНК и тежестта на патологията в проксималното дебело черво. Интересното е, че експерименталните групи, получаващи както LAM, така и/или FUC преди началото на DSS предизвикателство, са намалили изобилието на IL-6 mRNA, което може да подкрепи защитния ефект, придаден от тези водорасли полизахариди срещу DSS предизвикателство. Освен това, групата LAM + DSS е имала намалено изобилие от ентеробактерии, свързани с предизвикателство за DSS. Данните показват, че предварителната консумация на LAM и FUC предоставя някои доказателства за възможна роля на тези водорасли полизахариди в хранителната терапия за UC. Необходими са обаче повече изследвания, за да се установи способността за ефективна защита срещу развитието на патология, свързана с UC.

Благодарности

Авторите благодарят на Б. Флин, А. Уолш, М. Райън, П. Рейли и Д. Кънингам за техническа помощ.

Това проучване е финансирано от Enterprise Ireland и BioAtlantis Limited по Програмата за партньорство за иновации. Нито Enterprise Ireland, нито BioAtlantis Limited са играли роля в проектирането и анализа на настоящото проучване или в написването на тази статия.

C. J. O. S., J. V. O. D., J. J. C. и T. S. са проектирали изследването; C. J. O. S., J. V. O. D., J. J. C., K. T. и D. D. проведоха изследването и анализираха данни; и C. J. O. S., J. V. O. D., J. J. C. и T. S. са написали ръкописа. Всички автори прочетоха и одобриха окончателния ръкопис.