Допринесе еднакво за тази работа с: Banghong Wei, Zhigang Yang

диетичните

Роли Концептуализация, куриране на данни, формален анализ, разследване, методология, софтуер, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Присъединителен колеж по рибарство и наука за живота, Шанхайски океански университет, Шанхай, Китай

Допринесе еднакво за тази работа с: Banghong Wei, Zhigang Yang

Роли Концептуализация, придобиване на финансиране, методология, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Присъединителен колеж по рибарство и наука за живота, Шанхайски океански университет, Шанхай, Китай

Методология на ролите, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Присъединителен колеж по рибарство и наука за живота, Шанхайски океански университет, Шанхай, Китай

Придобиване на финансиране на роли

Присъединителен колеж по рибарство и наука за живота, Шанхайски океански университет, Шанхай, Китай

Методология на ролите, Софтуер

Присъединителен колеж по рибарство и наука за живота, Шанхайски океански университет, Шанхай, Китай

Роли Концептуализация, администриране на проекти, ресурси, надзор

Присъединителен колеж по рибарство и наука за живота, Шанхайски океански университет, Шанхай, Китай

  • Banghong Wei,
  • Джиганг Ян,
  • Jianyi Wang,
  • Акин Чен,
  • Qiuyan Shi,
  • Yongxu Cheng

Фигури

Резюме

Цитат: Wei B, Yang Z, Wang J, Chen A, Shi Q, Cheng Y (2017) Ефекти от диетичните липиди върху транскриптома на хепатопанкреаса на китайски раци от ръкавица (Eriocheir sinensis). PLoS ONE 12 (7): e0182087. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0182087

Редактор: Linsheng Song, Институт по океанология, Китайска академия на науките, КИТАЙ

Получено: 31 март 2017 г .; Прието: 12 юли 2017 г .; Публикувано: 28 юли 2017 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Това проучване беше подкрепено от Националната фондация за естествени науки на Китай [номера на безвъзмездните средства 31472287 (ZGY), 31402272 (AQC)].

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Китайският ръкав без ръкавици (Eriocheir sinensis) е местен вид в Източна Азия и се е превърнал в най-важния икономически вид рак в Китай [14]. Максималният растеж на повечето ракообразни може да бъде предизвикан от 2–10% от общите липиди в храната (сухо тегло) [15]. Повечето ракообразни предпочитат по-късите вериги и наситените мастни киселини за енергия [16]; полиненаситените мастни киселини (PUFA) също играят важна роля в много физиологични функции на ракообразните, например арахидоновата киселина (ARA, 20: 4n-6), EPA и DHA са тясно свързани с линенето [17] и могат да подобрят растежа и имунитет в ранните стадии на растеж на Litopenaeus vannamei [9]. Преди това бяхме изследвали липидното хранене на E. sinensis. Повечето от нашите резултати предполагат, че заместването на FO в диетата на E. sinensis е практично, при което растителното масло може частично да замести FO, без да влияе върху растежа, но съставът на мастните киселини може да бъде значително променен [18–20]. За да се увеличи заместването на FO, трябва да се изследва механизмът на ефектите от заместването на FO.

Техника за секвениране от следващо поколение, РНК секвениране (RNA-Seq), е новоразработена технология, използвана за изучаване на молекулярни механизми в биологичните изследвания [21], и е успешно използвана за изследване на E. sinensis. Повечето проучвания обаче са фокусирани върху развитието на E. sinensis, линеенето, имунните пътища, връзките между храненето и размножаването, осморегулацията и адаптацията към аблация на очните ставки [22–27]. Малко изследователи са изследвали ефектите на хранителните липидни ресурси върху Е. sinensis. В това проучване две растителни масла, които съдържат основно ω-3 и ω-6 мастни киселини, бяха избрани като заместител на рибеното масло в диетите на E. sinensis. Съотношението на заместването беше определено според нашите резултати преди. За да се илюстрира механизмът на заместване на рибеното масло, бяха добавени две групи с пълното заместване на рибеното масло, за да се увеличат ефектите от заместването. След това анализирахме хепатопанкреасния транскриптом на E. sinensis, хранени с различни диети, и определихме ефектите на различни диетични липиди върху липидния метаболизъм в E. sinensis.

Материали и методи

Експериментални диети

Пет изонитрогенни, изолипидни пречистени диети бяха формулирани от три липидни ресурса: FO, соево масло (SO) и ленено масло (LO). Таблица 1 изброява съставките на експерименталните диети. Диетите се оформят в гранули с диаметър 1,5 mm (диаметър) и се съхраняват при -20 ° C, докато се използват.

Експериментални животни и опити за хранене

Непълнолетни китайски раци от ръкавици са получени от изследователската база Чонгминг на Шанхайския океански университет и са били складирани в резервоари за 1 седмица за аклиматизация. През този период раците са били хранени с FO диета. След 1 седмица 60 здрави мъжки раци (първоначално тегло 2,15 ± 0,10 g) бяха разпределени на случаен принцип в пет групи (n = 12). Всеки рак във всяка група се култивира в една пластмасова кутия (36 cm × 18 cm × 18 cm). Групите бяха разпределени на случаен принцип с една експериментална диета и хранени веднъж дневно в 13:00 ч в продължение на 116 дни. Непоедената храна се отстранява със сифонна тръба след 2 часа. По време на експеримента водата се обменя веднъж дневно с 1/3–1/2 от обема на резервоара и се аерира по време на изпитанието за хранене. Фотопериодът беше приблизително 12 часа светлина: 12 часа тъмнина. Параметрите на качеството на водата се наблюдават 2–3 пъти седмично, за да се поддържат условия от 24,5–30,0 ° C, pH 8,0 ± 0,4, разтворен кислород> 5 mg/L и общ амонячен азот 1,0; РНК> 5 μg) се използва за анализ на транскриптома.

Библиотеката за транскриптоми на RNA-Seq се приготвя, използвайки Truseq RNA Sample Prep Kit (Illumina). PolyA mRNA беше пречистена с помощта на прикрепени към поли-Т олиго магнитни перли (Invitrogen) и беше произволно сегментирана на 200-bp фрагменти чрез фрагментационен буфер. След това, първа верига комплементарна ДНК (cDNA) се синтезира, използвайки обратна транскриптаза и произволни праймери, последвано от синтез на cDNA от втората верига. CDNA от втората верига беше възстановена в края с помощта на End Repair Mix (Illumina) и в края на 3'беше добавена единична A база за лигиране на адаптер. Целевите фрагменти на cDNA бяха избрани на 2% ултра агароза с нисък обхват (Bio-Red), последвано от 15 цикъла на PCR амплификация. След количествено определяне на TBS-380 (Invitrogen), беше извършен мостов PCR за амплифициране на ДНК фрагментите до едномолекулни ДНК клъстери, които впоследствие бяха използвани в последователността HiSeq 4000 (Illumina).

De novo сглобяване и анотиране

След качествено изрязване и изрязване на адаптер от SeqPrep (https://github.com/jstjohn/SeqPrep) и Sickle (https://github.com/najoshi/sickle), бяха получени чисти данни за RNA de novo сглобяване с Trinity (http: //trinityrnaseq.sourceforge.net/, Версия: trinityrnaseq-r20140413) [28]. За анотация събраните транскрипти бяха подравнени с базите данни на NCBI белтък (Nr), STRING, Swiss-Prot и Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), използващи BlastX (Версия 2.2.25), с отсечена E- стойност −5. Функционалната класификация на генната онтология (GO) беше проведена, за да се получат GO анотации за описване на биологични процеси, молекулярни функции и клетъчни компоненти, използвайки Blast2GO (http://www.blast2go.com/b2ghome) [29]. KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) е използван за анализ на пътищата, в които са включени стенограмите.

Диференциална генна експресия и функционално обогатяване

Изобилието на експресия се определя с помощта на RSEM (http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/) [30]. Броят на четенията беше получен чрез картографиране на всяка проба към съответния ген. Нивата на генна експресия бяха измерени според метода на фрагментите на килобаза от модел на екзон на милион картирани четения (FPKM). Анализът на диференциална експресия беше извършен с помощта на edgeR (http://www.bioconductor.org/packages/2.12/bioc/html/edgeR.html). Гените се считат за значително диференцирано изразени (DEG), когато формулата за скорост на фалшиво откриване -ΔΔCt). Получава се ΔCt във формулата: ΔCt = Ct интересен ген - Ct вътрешен контрол, след което се избира максимален ΔCt като ΔCtmax, ΔΔCt се изчислява във формулата: ΔΔCt = ΔCt − ΔCtmax. Тогава относителните изрази на всеки ген бяха дефинирани чрез 2 -ΔΔCt, повече информация за формулировката на формулата за сравнителен прагов цикъл (2 -ΔΔCt) беше посочена на Schmittgen [31]. След лог-трансформация, стойността на FPKM за всяка група в RNA-seq са сравнени с резултатите от qRT-PCR за валидиране на RNA-Seq.

Резултати

Последователност и сглобяване de novo

След секвениране, качествено подрязване и изрязване на адаптера са получени общо 320 973 688 четения от хепатопанкреаса на E. sinensis, хранени с FO, SO, LO, FSO (FO + SO) или FLO (FO + LO) диета (Таблица 3) и използва се за сглобяване de novo. Получихме 70 591 преписа след сглобяването и преписите бяха допълнително групирани в 55 167 унигена. Средната дължина на транскрипта и унигена е била съответно 946 bp и 1083 bp. Таблица 4 показва останалите статистически данни за събранието. Около 22 760 преписи (32,24%) и 20 929 унигени (37,94%) са с дължина 1–400 bp, което представлява по-голямата част от стенограмите и унигените.

Анотация на унигени

Сглобените унигени бяха подравнени с базите данни Nr, STRING, Swiss-Prot и KEGG с помощта на BlastX. От събраните унигени, 25 920 (46,98%), 17 499 (31,72%) и 14 532 (26,34%) са съответствали в базите данни Nr, Swiss-Prot и KEGG, съответно; само 5820 (10,55%) са съответствали в базата данни STRING. До 13 305 унигена бяха съпоставени в базата данни Nr с 0 −10 .

Анализ на DEG

qRT-PCR валидиране на RNA-Seq

За да се проверят резултатите от RNA-Seq, 10 произволно избрани гена в същите проби от РНК на хепатопанкреас са анализирани чрез qRT-PCR. Резултатите от RNA-Seq и qRT-PCR са сравнени на фигура 7 и потвърждават надеждността на RNA-Seq.

Дискусия

През предишните години анализът на транскриптома се прилага широко в биологичните изследвания. При ракообразните хепатопанкреасът е основен орган за съхранение и метаболизъм на липиди, който има същите функции като мастната тъкан и черния дроб при гръбначните [32, 33]. Хепатопанкреасът е отговорен и за биосинтеза на някои хормони; следователно, той е идеалният орган за изследване на транскриптомни промени след хранене с различни липидни диети [34]. В това проучване анализирахме ефектите на различни диетични липидни ресурси върху транскриптома на E. sinensis hepatopancreas. Диетичните липидни източници са имали очевидни ефекти върху липидното храносмилане, абсорбцията и метаболизма при Е. sinensis.

Синтезът de novo на мастна киселина също е значително променен от диетичния липид. Синтезът на мастни киселини включва два етапа: ACC и FAS катализират първия, а след това мастните киселини, синтезирани от ACC и FAS, се удължават допълнително и се насищат в дълговерижни ненаситени мастни киселини [49]. Реакцията започва със синтеза на малонил-КоА от ацетил-КоА, катализиран от АСС. След това се осъществяват последователни реакции на кондензация на Claisen, катализирани от FAS с ацетил-КоА и малонил-КоА [50]. Съобщава се, че експресията на FAS и ACC в CaCo-2 клетките може да има тясна връзка с мастните киселини [51]. В настоящото проучване, в сравнение с групата на FO, FAS беше понижена в SO, LO и FLO групите, а ACC беше понижена в FLO групата. Най-голямата разлика между диетите FO, SO, LO и FLO е съставът на мастните киселини. Въпреки това, в сравнение с растителното масло, FO може значително да насърчи експресията на FAS. предположихме, че това се дължи на високото съдържание на 14: 0 в диетата на FO, което е субстратът на FAS.

Но в настоящото проучване експресията на мастна ацил Δ9-десатураза е значително променена в SO, LO и FLO групите. Мастната ацилова Δ9-десатураза е ензимът, ограничаващ скоростта в биосинтеза на мононенаситени мастни киселини и може да въведе двойна връзка в палмитоил-КоА (16: 0) и стеароил-КоА (18: 0) [64]. Гуо и колеги бяха първите, които изолираха мастна ацил Δ9-десатураза от Е. sinensis [55] и тя беше характеризирана в BL21 (DE3) pLysS, мастната ацил А9-десатураза в Е. sinensis имаше активност при десатурацията на С18: 0 [65]. Тъй като високото съдържание на 18: 1n-9 в растителното масло, експресията на мастна ацил Δ9-десатураза във FO е значително по-ниска от растителното масло. Спекулираме, че високото съдържание на 18: 1n-9 в растителното масло е продукт на реакцията, в която участва мастната ацил Δ9-десатураза, като по този начин инхибира експресията на мастна ацил Δ9-десатураза в E. sinensis.

Заключения

Ефектите от диетичните липидни ресурси върху китайския ръкав от ръкавици са анализирани с анализ на транскриптома, който показва, че диетичните липиди имат очевидни ефекти върху липидния метаболизъм в хепатопанкреаса на раците. Замяната на FO с растителни масла значително променя храносмилането и усвояването на мазнините, метаболизма на мастните киселини, разграждането на мастните киселини, биосинтеза на мастни киселини, биосинтеза на ненаситени мастни киселини и много други пътища на метаболизма на липидите. В сравнение с FO, нарастващото добавяне на SO и LO в диетите на раците може да намали храносмилането и усвояването на хранителните липиди, биосинтеза на мастни киселини и имунологичната защита на вируса и да увеличи β-окислението чрез промяна на експресията на гените за PL, ACSL, CPTI, ACC, FAS, мастна ацил Δ9-десатураза, TLR, STAT и други подходящи гени. Въпреки това, подробностите за ефектите на хранителните липиди върху рака от китайски ръкавици са все още неясни; бъдещите проучвания трябва да използват геномната последователност на E. sinensis за подобряване на транскриптома. Нещо повече, настоящото проучване е проведено на ниво транскрипция; експресията на протеини също трябва да се анализира, за да се разбере по-нататък липидният метаболизъм на китайски раци без ръкавици, хранени с различни липидни диети.