Роли Концептуализация, куриране на данни, формален анализ, разследване, методология, администриране на проекти, писане - оригинален проект

тетрациклин

Институт по експериментална медицина, Национален център за медицински изследвания Алмазов, Санкт Петербург, Руска федерация, Научноизследователски център „Пробиокод SP”, Москва, Руска федерация

Роли Куриране на данни, разследване, методология, валидиране

Институт по експериментална медицина, Национален медицински изследователски център Алмазов, Санкт Петербург, Руска федерация, Катедра по патофизиология, Санкт Петербургски държавен медицински университет, Санкт Петербург, Руска федерация

Роли Куриране на данни, Формален анализ, Методология, Софтуер

Научен изследователски център „Пробиокод SP”, Москва, Руска федерация, Катедра по физиология и санокреатология, Приднестровски държавен университет „Шевченко”, Тираспол, Република Молдова

Роли Куриране на данни, Формален анализ, Визуализация

Отделение за микроелектроника и биомедицинско инженерство, Технически университет в Молдова, Кишинев, Република Молдова

Разследване на ролите, методология, валидиране

Институт по експериментална медицина, Национален медицински изследователски център Алмазов, Санкт Петербург, Руска федерация, Катедра по патофизиология, Санкт Петербургски държавен медицински университет, Санкт Петербург, Руска федерация

Роли Формален анализ, Методология, Софтуер, Визуализация

Институт по експериментална медицина, Национален център за медицински изследвания Алмазов, Санкт Петербург, Руска федерация

Роли Куриране на данни, формален анализ, разследване

Институт по експериментална медицина, Национален център за медицински изследвания Алмазов, Санкт Петербург, Руска федерация, Научноизследователски център „Пробиокод SP“, Москва, Руска федерация

Роли Концептуализация, придобиване на финансиране, администриране на проекти, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Институт по експериментална медицина, Национален медицински изследователски център Алмазов, Санкт Петербург, Руска федерация, Катедра по патофизиология, Санкт Петербургски държавен медицински университет, Санкт Петербург, Руска федерация

  • Юрий Ю Борщев,
  • Саркис М. Минасян,
  • Инеса Ю Буровенко,
  • Виктор Ю Борщев,
  • Егор С. Процак,
  • Наталия Ю Семенова,
  • Олга В. Борщева,
  • Майкъл М. Галагуджа
  • Член
  • Автори
  • Метрика
  • Коментари
  • Медийно покритие
  • Партньорска проверка

Фигури

Резюме

Заден план

Последните данни показват, че индуцираните от антибиотици промени в състава на чревната микрофлора, както и системните имуноендокринни ефекти, произтичащи от тях, могат да модулират миокардната толерантност към исхемично-реперфузионно увреждане. Целта на това проучване е да се изследват ефектите на тетрациклин (TTC) върху размера на инфаркта на миокарда в изолираните сърца, получени от затлъстели плъхове с химически индуциран колит (CIC). Изследвана е и връзката между индуцираните от TTC промени в размера на инфаркта и чревния микробиомен състав, както и плазмените нива на цитокини и късоверижни мастни киселини (SCFA).

Методи

Затлъстяването се предизвиква при плъхове Wistar, като им се дава диета с високо съдържание на мазнини и въглехидрати в продължение на пет седмици. Еднократно ректално приложение на 3% оцетна киселина (2 ml) на плъхове води до CIC. Здрави плъхове, както и затлъстели плъхове с CIC получават TTC (15 mg дневно в продължение на 3 дни) чрез сондаж. Плъховете бяха евтаназирани, след което беше извършена изолирана сърдечна перфузия със симулирана глобална исхемия и реперфузия. Размерът на инфаркта се определя хистохимично. Нивата на липополизахарид (LPS) и цитокини в плазмата са измерени чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ, докато нивата на SCFA в плазмата са измерени чрез газова хроматография/масспектрометрия. Чревният микробиом се анализира, като се използва полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция.

Резултати

Лечението с TTC доведе до значително ограничение на размера на инфаркта (50 ± 7 срещу 62 ± 4% за контролните мишки, р 2 преживя масивна смърт от кардиомиоцити и разви хронична сърдечна недостатъчност [5]. Съобщава се също, че фунгицидните лекарства, принадлежащи към семейство ехинокандин може да причини кардиотоксичност [6].

Нашите открития потвърдиха ограничаващия инфаркта ефект на TTC при здрави плъхове. Съвместното съществуване на DIO и CIC обаче обърна кардиопротективния ефект на TTC. Размерът на инфаркта е значително по-голям в сърцата, получени от лекувани с TTC затлъстели животни с CIC, отколкото в сърцата на контролните плъхове. Този ефект на TTC не е свързан с промени в нивата на SCFA, но може да се отдаде на специфичен профил на чревната микробиота, степента на ендотоксемия или дисбаланс на цитокините. Нашите открития подкрепят предпазливата употреба на антимикробни средства при пациенти със съпътстващи заболявания, които също имат висок риск от остър коронарен синдром.

Материали и методи

Декларация за етика

Всички процедури бяха извършени в съответствие с Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни (публикация NIH № 85–23, ревизирана 1996 г.) и Европейската конвенция за защита на гръбначните животни, използвани за експериментални и други научни цели. Институционалният комитет по грижи и употреба на животните към Националния център за медицински изследвания Алмазов одобри протокола за изследване (протокол № 17-DI-1; 30 май 2017 г.). По време на проучването бяха положени всички усилия за защита на животните и минимизиране на страданията им. Експериментите са в съответствие с насоките ARRIVE (http://www.nc3rs.org/ARRIVE).

Животни

За изследването са получени мъжки плъхове Wistar (възраст 11-12 седмици; тегло 300-320 g). Животните се поддържат в рамките на 12/12-часов цикъл светлина/тъмнина и им се предоставя свободен достъп до храна и вода.

Реактиви

Всички химикали, използвани в експериментите, са с аналитичен клас и са закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ), освен ако не е посочено друго.

Развитие на DIO при плъхове

DIO е разработен при животните чрез хранене с богата на мазнини и с високо съдържание на въглехидрати диета (HFCD; 40% мазнини, 45% захароза; Dyets Inc., Bethlehem, PA, USA) в продължение на пет седмици преди сърдечна изолация [15].

Индукция на колит

Колит се индуцира при плъхове с DIO чрез еднократно ректално приложение на 3% оцетна киселина (2 ml) с помощта на полиетиленова тръба (2 mm в диаметър), която се вкарва в ректума на дълбочина 5,5 cm [16]. Плъховете бяха разположени така, че задните крайници да се издигат над главата по време на ректалната инстилация и за 1 минута след това, за да се предотврати изтичането на разтвора.

Експериментален дизайн

Животните бяха разпределени на случаен принцип в следните пет групи (Фигура 1): контрол (CON, n = 14, всеки плъх получи 1 ml от носителя), TTC (n = 13, всеки плъх получи 15 mg TTC в 1 ml нормален физиологичен разтвор ), DIO (п = 14, плъхове с DIO бяха третирани с носителя), DIO + CIC (п = 14, плъхове с DIO и CIC бяха третирани с носителя) и DIO + CIC + TTC (п = 14, плъхове с DIO и CIC са лекувани с TTC). Всяко лечение се прилага веднъж дневно в продължение на три дни по интрагастрален път. След последния ден от лечението, животните бяха оставени да се възстановят в продължение на пет дни преди сърдечната изолация. Всички животни, с изключение на тези от групите CON и TTC, са били хранени с HFCD по време на периода на възстановяване. По време на проучването групите CON и TTC получават стандартен чау (12% мазнини, 0% захароза; Lab Diet, Сейнт Луис, МО, САЩ). В 9: 00–10: 00 сутринта всеки ден през седемте дни преди събиране на сърцето се записват следните подробности: клинично състояние, телесно тегло и консумация на вода и храна. След направена аутопсия сляпата и ретроперитонеалната, епидидимална и висцерална мазнини бяха изрязани и претеглени.

За подробности вижте текста. AA –оцетна киселина, HFCD – диета с високо съдържание на мазнини, високо въглехидрати, Veh-носител, TTC-тетрациклин, SCFA-мастни киселини с къса верига.

Оценка на биохимични и имунологични параметри

Кръв от сафенозна вена е взета за анализ на биохимични и имунологични параметри, използвайки стандартна техника за вземане на кръв един ден преди изолирането на сърцето. Пълна кръв се центрофугира два пъти при 3000 rpm в продължение на 10 минути, за да се получи серум. Биохимичен анализатор (BioChem Analette; HTI, North Attleboro, MA, USA) се използва за определяне на серумните нива на лактат, лактат дехидрогеназа (LDH), алкална фосфатаза (ALP), урея и пикочна киселина. Серумните концентрации на тумор некротизиращ фактор-алфа (TNF-α), интерлевкин (IL) -8, моноцитен хемоаттрактант протеин-1 (MCP-1), С-реактивен протеин (CRP) и липополизахарид (LPS) бяха измерени с помощта на ензим комплекти за свързан имуносорбентен анализ (ELISA) (MR-96A; Mindray, Шенжен, Китай) съгласно инструкциите на производителя. Всеки тест ELISA се извършва в три екземпляра.

ДНК екстракция и анализ на чревната микробиота

Профилите на чревната микробиота във фекални проби бяха определени на два етапа. Първо, ДНК беше извлечена от супернатантите на фекални суспензии с помощта на комплект за екстракция на ДНК (QIAamp DNA Stool Mini Kit; QIAGEN, Hilden, Германия) в сух блок нагревател (Termit; DNA-Technology LLC, Москва, Руската федерация), последвано от инкубация. След това се извърши полимеразна верижна реакция в реално време (PCR), използвайки T100 ™ Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) и реакционната смес Colonoflor-16 (Alpha-Lab, Санкт Петербург, Руска федерация). Анализът на кривата на стопилката се извършва веднага след амплификация, за да се идентифицира целевият PCR продукт, който след това се определя количествено с помощта на спектрофотометър (NanoDrop ND-1000; Peqlab, Erlangen, Германия). Броят на бактериите се изразява в колониеобразуваща единица (CFU)/g.

Анализ на SCFA

Плазмените концентрации на SCFAs бяха оценени чрез газова хроматография с откриване на пламъчна йонизация (GC-FID). Измервани са концентрациите на следните SCFA: оцетна, пропионова, изобутринова и изовалерианова киселини. SCFAs бяха идентифицирани по техните времена на задържане и характерни йонни фрагменти с използване на режима на избран мониторинг на йони в GC-FID система (Agilent 7890A; Agilent Technologies, Wilmington, NC, USA). Количественото определяне на SCFA беше направено чрез автоматична интеграция на хроматограми, използвайки GC/MSD ChemStation софтуер (Agilent Technologies).

Изолирана сърдечна перфузия според Лангендорф

Плъховете се упояват с натриев пентобарбитал (60 mg/kg интраперитонеално). Всяко сърце се изрязва чрез двустранна торакотомия и се перфузира през възходящата аорта с буфер на Krebs-Henseleit (състоящ се от следното [в mmol/L]: NaCl, 118,5; KCl, 4,7; NaHCO3, 25; KH2PO4, 1,2; MgSO4, 1,2; глюкоза, 11 и CaCl2, 1,5) при постоянно налягане от 85 mm Hg [17]. Налягането на перфузия се поддържа от гравитацията чрез използване на двустенна стъклена колона с водна риза, свързана към аортната канюла чрез трипътен кран. Буферното оксидиране се извършва с въглерод (95% O2 плюс 5% CO2), доставен през инвертиран филтриран стъклен филтър.

Систоличното налягане в лявата камера (LVSP) и крайното диастолично налягане в лявата камера (LVEDP) се измерват изоволуметрично с помощта на нееластичен полиетиленов балон, въведен в лявата камера през лявото предсърдие. Балонът беше прикачен към инсулинова спринцовка и напомпан с 0,4-0,6 ml преварена вода, за да се получи LVEDP от th min реперфузия. В допълнение, лявото вентрикуларно налягане (LVP) беше измерено при 5, 10, 15, 20, 25 и 30-та минута на глобалната исхемия. Всяко сърце с HR от 18 или 100 mm Hg, когато LVEDP се поддържа на Фигура 2. Ефекти от различни режими на лечение върху телесното тегло на животните, приема на храна и вода, както и теглото на висцералната мастна тъкан и сляпото черво.

(A) Седмични промени в телесното тегло, (B) вода и (C) прием на храна и (D) висцерална мастна тъкан и (E) слепи тегла. Данните са изразени като средна стойност ± SD. * показва р Таблица 1. Биохимични серумни маркери при плъхове Wistar в края на експеримента.

Резултатите показват средни стойности и стандартни отклонения.

Резултатите показват средни стойности ± SD.

Чревен микробиом

Относителният брой на някои чревни бактерии (Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Escherichia coli, Faecalibacterium prausnitzii, Bacteroides fragilis и Akkermansia muciniphila), както и общият брой на бактериите са представени на фиг. 3. Общ брой на бактериите и Bacteroides frag броя бяха значително по-ниски в групите TTC и DIO + CIC + TTC, отколкото в групата CON (Фигура 3А и 3F). Освен това беше установено, че броят на Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. И Akkermansia muciniphila е намален в групата DIO (Фигура 3В, 3С и 3G). Животните както с DIO, така и с CIC имат по-нисък брой на Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp. но броят на Escherichia coli е по-висок от този в групата CON (Фигура 3B – 3D). Подобни промени в профилите на микробиота са наблюдавани в групата DIO + CIC + TTC. Популацията на Faecalibacterium prausnitzii обаче не се различава сред петте групи.

(А) Общ брой бактерии. (B) Lactobacillus spp., (C) Bifidobacterium spp., (D) E. coli, (E) Faecalibacterium prausnitzii, (F) Bacteroides fragilis и (G) Akkermansia muciniphila във фекални проби са анализирани чрез RT-PCR. Резултатите са представени като средна стойност ± SD и изразени в CFU/g. * показва р 0,05, когато стойността се сравнява с данните за групата CON). Нивата на пропионова, изобутринова и изовалерианова киселини не се различават между групите (Фиг. 4В – 4D).

Плазмените концентрации на (A) оцетна киселина, (B) пропионова киселина, (C) изобутринова киселина и (D) изовалерианова киселина се определят чрез GC-FID. Резултатите са представени като средна стойност ± SD. * показва p Фигура 5. Функционални параметри и размер на инфаркта на миокарда в изолирани сърца на плъхове, подложени на 30 минути глобална исхемия, последвано от 120 минути реперфузия.

(A) Исхемична контрактура, (B) LVP, (C) LVEDP и (D) CFR стойности на изходно ниво и по време на реперфузия. Данните са представени като средно ± SD. (E) Резултатите от размера на инфаркта се представят като точкови графики със средни стойности. (F) Представителни изображения на сърдечни филийки, оцветени с трифенилтетразолиев хлорид. * показва p Фиг. 6. Валидиране на CIC модел чрез хистопатологично изследване на дебелото черво.

Взети са проби от дебелото черво от животни в (A) CON, (B) TTC, (C) DIO, (D) DIO + CIC и (E) DIO + CIC + TTC групи в края на експеримента, фиксирани в параформалдехид, и оцветени с H&E. Извършен е морфометричен анализ за определяне (F) на общата дебелина на чревната стена и дебелината на лигавицата. Разрезите на тъканите се наблюдават под микроскоп при увеличение 100 пъти. Мащабната лента е 100 μm за всички изображения. Изображенията са представителни за поне четири независими раздела. * показва p 2+. Този ефект е от значение при кардиопротекцията, тъй като исхемията-реперфузия в сърцето на плъх води до повишена активност на матричната металопротеиназа-2 [23]. Доксициклинът обаче предотвратява това активиране, подобрява функционалното възстановяване по време на реперфузия и намалява протеолизата на тропонин I и миозин. Това означава, че тетрациклините проявяват защитен ефект срещу IRI в различна степен.

Ефектите на DIO върху миокардната толерантност към IRI остават противоречиви. Посочено е, че IRI на сърцето се влошава при животни със затлъстяване, индуцирано от високо съдържание на мазнини (HFD). Това е в съответствие с клиничните данни за повишената чувствителност на пациентите със затлъстяване към миокардна исхемия [29]. За разлика от това, други доклади предполагат, че HFD може да причини парадоксално повишаване на сърдечната устойчивост към IRI, което може да се обясни със забавено нормализиране на вътреклетъчното pH при реперфузия [30,31]. Тъй като не сме изследвали миокардната толерантност към IRI в in vivo модела в настоящото проучване, можем само да заключим, че DIO в това проучване не е оказал ефект върху миокардната толерантност към IRI в изолиран сърдечен модел.

Настоящото проучване имаше няколко методологически ограничения. Първо, RT-PCR, вместо метагеномния анализ на „златния стандарт“, беше използван за характеризиране на микробиома. Това беше така, защото на текущия етап от нашия проект възнамерявахме да извършим целенасочена идентификация на определени родове и видове бактерии. На второ място, медиираната от TTC кардиопротекция не се оценява отделно в групите DIO и CIC, а само при животните с двете патологии. На трето място, молекулярният (ите) механизъм (и), лежащ в основата на TTC-индуцирана кардиопротекция и неговата загуба при плъхове с DIO и CIC не са изследвани. Понастоящем можем да обсъдим само връзките между размера на инфаркта, състава на микробиотата и плазмените нива на цитокини. Причинните роли на тези фактори в ограничаването на размера на инфаркта обаче трябва да бъдат проучени в допълнителни проучвания за доказателство за концепция.

В заключение, нашите данни потвърждават, че TTC има кардиопротективен ефект при здрави животни. Този ефект обаче е обърнат при затлъстели животни с CIC, което е свързано със специфични промени в чревната микробиота и значително повишени нива на цитокини и LPS в плазмата. Нашите открития показват, че някои антимикробни лекарства не трябва да се използват при пациенти със затлъстяване и съпътстващи възпалителни заболявания. Това се дължи на повишения риск от миокардно увреждане и неблагоприятен изход от миокарден инфаркт.