Лангстън Т. Холи

1 Катедра по неврохирургия, Медицински факултет на Дейвид Гефен в UCLA, Лос Анджелис, Калифорния

Доналд Бласкевич

1 Катедра по неврохирургия, Медицински факултет на Дейвид Гефен в UCLA, Лос Анджелис, Калифорния

Айгуо Ву

2 Катедра по интегративна биология и физиология, Калифорнийски университет, Лос Анджелис, Калифорния

Камерън Фън

2 Катедра по интегративна биология и физиология, Калифорнийски университет, Лос Анджелис, Калифорния

Дже Ин

2 Катедра по интегративна биология и физиология, Калифорнийски университет, Лос Анджелис, Калифорния

Фернандо Гомес-Пинила

1 Катедра по неврохирургия, Медицински факултет на Дейвид Гефен в UCLA, Лос Анджелис, Калифорния

2 Катедра по интегративна биология и физиология, Калифорнийски университет, Лос Анджелис, Калифорния

Свързани данни

Резюме

Обект

Патогенезата на цервикалната спондилозна миелопатия (CSM) е свързана както с първично механично, така и с вторично биологично увреждане. Авторите на това проучване изследват нов, неинвазивен метод за насърчаване на невропротекцията при миелопатия чрез използване на куркумин за минимизиране на оксидативното клетъчно увреждане и способността на омега-3 мастните киселини да поддържат мембранната структура и подобряват невротрансмисията.

Методи

Животински модел на CSM е създаден с помощта на неразглобяем разширяващ се полимер, поставен в епидуралното пространство на гръдния кош, което индуцира забавена миелопатия. Животните, подложени на поставяне на разширяващия се полимер, са били изложени или на диета, богата на докозахексаенова киселина и куркумин (DHA-Cur), или на стандартна западна диета (WD). Двадесет и седем животни бяха подложени на серийно тестване на походката и бяха извършени молекулярни оценки на гръбначния мозък след 6-седмичния период на изследване.

Резултати

В края на периода на изследване анализът на походката разкрива значително по-лоша функция в групата с WD, отколкото в групата на DHA-Cur. Измервани са нива на мозъчно-извлечен невротрофичен фактор (BDNF), синтаксин-3 и 4-хидроксиноненал (4-HNE) в гръдната област, засегната от компресия и лумбално уголемяване. Резултатите показват, че нивата на BDNF в групата на DHA-Cur не се различават значително от тези при непокътнатите животни, но са значително по-големи, отколкото в групата с WD. Значително по-висок лумбален разширен синтаксин-3 при DHA-Cur животни, съчетан с намаляване на липидната пероксидация (4-HNE) показва възможен лечебен ефект върху плазмената мембрана.

Заключения

Данните в това проучване показват, че DHA-Cur може да насърчи невропротекцията на гръбначния мозък и да неутрализира клиничните и биохимичните ефекти на миелопатията.

Цервикалната спондилозна миелопатия е потенциално инвалидизиращо разстройство, причинено както от първична механична, така и от вторична биологична SCI. Хирургичното му управление е претърпяло значителна еволюция през последните няколко десетилетия, подобрявайки способността ни да се справяме с първичното механично увреждане. Въпреки напредъка в гръбначния инструментариум и оперативната техника обаче, неврологичното възстановяване все още може да бъде относително ограничено при много пациенти след операция.

Едно от най-големите ни предизвикателства при лечението на пациенти с CSM е невъзможността да се лекува директно коварното вторично биологично увреждане, което повсеместно възниква при това разстройство. Вероятно тази бариера е отговорна главно за липсата на смислено неврологично възстановяване при някои пациенти след операция, както и за разпространението на SCI и прогресирането на заболяването при лекуваните неоперативно. По този начин има очевидна необходимост от разработване на терапии и алгоритми за лечение директно адресиране на вторичното биологично увреждане, свързано с хронична ТСМ и което може да подобри възстановителните процеси след неоперативно лечение или хирургична декомпресия.

През последните години нараства интересът към влиянието на хранителните фактори върху специфични молекулярни системи и механизми в ЦНС. По-специално, омега-3 мастната киселина DHA показва терапевтичен потенциал въз основа на нейните ефекти при намаляване на възпалението и осигуряване на структурен материал на плазмените мембрани и върху неговите ефекти върху цялостната невронална функция. 3 На свой ред, куркуминът притежава силен противовъзпалителен и антиоксидантен капацитет 20, 23, така че комбинираните действия на DHA и куркумин могат да бъдат потенциална стратегия за противодействие на биологичното увреждане, възникнало в CSM.

Най-голямо внимание е насочено към мозъка и редица проучвания показват ползата от хранителните добавки върху церебралната функция, като паметта и обучението, както и за подобряване на невронното възстановяване на щетите, причинени от патологични процеси, включително болестта на Алцхаймер, 4 епилепсия, 8 и черепно-мозъчна травма. 20, 23 За разлика от това е публикувана сравнително малко информация относно използването на хранителни добавки за подобряване на невронния ремонт при нарушения, засягащи гръбначния стълб, и това представлява плодородна област за изследване. Целта на настоящото проучване беше да се изследва нов, неинвазивен метод за насърчаване на невропротекцията в животински модел на миелопатия чрез използване на комбинираното приложение на DHA и куркумин.

Методи

Експериментален дизайн

Двадесет и седем мъжки плъха Sprague-Dawley (Charles River) с тегло между 200 и 250 g бяха настанени по 2-3 на клетка и се държат в контролирани от околната среда помещения (22 ° -24 ° C) с 12-часов цикъл светлина/тъмнина. След 1 седмица на аклимация, плъховете бяха разпределени на случаен принцип в 3 групи, състоящи се от по 9 животни: компресия на гръбначния стълб и диета, допълнена с наситени мазнини, предназначена да възпроизвежда диета на западното общество 9 (62% наситени мазнини, 34% захароза; D12079B, изследвания Diets, Inc .; WD група), компресия на гръбначния стълб и диета (102566, Dyets, Inc.), допълнена с DHA (1,2%, Nordic Naturals, Inc.) и куркумин (500 ppm, Sigma Corp .; DHA-Cur група) и непокътнати със стандартна диета (контролна група). Животните с компресия на гръбначния стълб претърпяха поставяне на тънък епидурален нерезорбируем полимер в средно-гръдния отдел на гръбначния стълб, предназначен да предизвика забавен неврологичен дефицит. Признатите диети се прилагат на плъховете след операцията и животните се оставят да се хранят ad libitum в продължение на 6 седмици. Изследователите на молекулярните и функционални тестове бяха заслепени за лечебните рамена.

Експериментите бяха извършени в съответствие с Ръководството на Националния изследователски съвет за грижа и използване на лабораторни животни. Комитетът за изследвания на животните на канцлера на UCLA одобри всички процедури.

Хирургични процедури

Процедура за ядрено-магнитен резонанс

Три животни са подложени на ЯМР на гръдния кош на гръбначния стълб 2 седмици следоперативно, за да получат рентгенографско потвърждение, че компресията на гръбначния канал е предизвикана от модела (Фиг. 1). Използван е високополест, малък отвор Bruker MRI Bio-Spec 70/30 (Bruker BioSpin) 7-T магнит. Той има 30 см отвор с електроника Avance и се управлява от операционния софтуер ParaVision 5.0. Изображенията са получени с помощта на 166 mm BGA градиентна система и приемо-предавател с обем 60 cm.

диетична

Сагитално торакално MR изображение, показващо компресия на гръбначния мозък, причинено от поставената отзад гъба (червена стрелка). Синята стрелка показва област с нормален рострален калибър на гръбначния мозък до зоната на компресия.

Тестване на поведението

Тест на CatWalk

Преди операцията животните бяха подложени на изходно тестване на походката, използвайки автоматизираната система за анализ на походката CatWalk (Noldus Information Technology). Апаратът е направен от стъклена плоча с дължина 1,3 m с приглушена флуоресцентна светлина, излъчена в стъклото отстрани. В затъмнена среда (под 1 лукс осветеност) светлината се отразява надолу и когато лапите на животното влязат в контакт със стъклената повърхност, изображенията на стъпките се записват от камерата под пътеката (фиг. 2). Изображенията от всяко изпитание бяха преобразувани в цифрови сигнали и обработени с праг, зададен на 30 au (диапазон 0–225 au), което означава, че бяха използвани всички пиксели, по-ярки от 30 au. Настройката за изображения, използвана в това проучване, определя 1 пиксел като 0,085 mm. Плъховете бяха подложени на 3 последователни опити във всеки тест. Данните бяха събрани в компютъра и анализирани с помощта на софтуера CatWalk XT.

Горен: Снимка на животно от групата DHA-Cur, показваща крака, подходящо поставени върху лъча на баланса, докато се разхождате по време на поведенчески тестове. Нисък: Снимка на животно от групата на WD, демонстриращо грешка на крака с подхлъзване на десния заден крак над страната на гредата.

Тест за разходка с лъч

Тестът за ход на лъча беше извършен, както беше описано по-горе. 25 Този тест се използва за оценка на фината двигателна координация на всички животни. Устройството се състои от тясна дървена греда с ширина 10 мм и дължина 180 мм и е окачена на 400 мм от плота на масата. Плъховете бяха заснети на видео, докато вървяха в двете посоки на лъча. Разломите на краката (липсващи или хващащи страните на гредата) над 50 стъпала са отчетени в двете посоки на гредата.

Молекулярна оценка

Всички плъхове бяха евтаназирани 42 дни след хирургичната процедура, дори непокътнатите. Средно-гръдният участък (приблизително 5 mm цефаладен и каудален до вдлъбнатия участък на гръбначния мозък, където е поставена гъбата) и лумбалният уголемен участък са били дисектирани и съхранени при -70 C ° за анализ на протеини. Протеинови екстракти бяха приготвени в лизисен буфер (137 mM NaCl; 20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1% NP-40; 10% глицерол; 1 mM фенилметилсулфонил флуорид; 10 mg/ml апротинин; 1 mg/ml левпептин; и 0,5 тМ натриев ванадат). Хомогенатите се обработват в центрофуга и се събират супернатантите. Общите протеини бяха количествено определени съгласно процедурата MicroBCA (Pierce).

Двадесет и пет микрограма протеин от всяка проба бяха използвани за Western blot анализ. Мембраните бяха инкубирани за една нощ със следните първични антитела: анти-BDNF (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology), анти – 4-HNE (1: 1000), антисинтаксин-3 (1: 1000) и антиактин (1: 2000 ) се използва като вътрешен стандарт. Вторичните антитела са антикоза или заешка имуноглобулин G-хрянова пероксидаза (Santa Cruz Biotechnology). След изплакване с буфер (0,1% Tween-20 в TBS), имунокомплексите се визуализират чрез хемилуминесценция, като се използва комплектът за откриване на блотинг Amersham ECL Plus Western (GE Healthcare Life Sciences), съгласно инструкциите на производителя. Филмовите сигнали бяха сканирани дигитално с помощта на скенер Hewlett-Packard (HP Scanjet 3970) и количествено определени със софтуера NIH Image, нормализиран за нивата на актина.

Статистически анализ

Видео 1. Клип на животно от групата на WD, демонстриращо значителни затруднения в походката при ходене през гредата в следоперативния ден от 42-ия ден. Щракнете тук, за да видите с Media Player. Щракнете тук, за да видите с Quicktime.

Видео 2. Клип на животно от групата DHA-Cur, който се движи през лъча, без никакви грешки в крака в следоперативния ден 42-ия ден. Щракнете тук, за да видите с Media Player. Щракнете тук, за да видите с Quicktime.

Молекулярна оценка

Ефекти от диетата в гръдния регион

Стълбовидни графики, показващи резултати от молекулен анализ на гръдната област. A: Нивата на 4-HNE в гръдната област на мястото на компресия са значително повишени в групата с WD в сравнение както с интактните, така и с DHA-Cur групите (** p Фиг. 6А). Няма значителна разлика в нивата на лумбалните 4-HNE между групата DHA-Cur и интактната група (p> 0,05). Нивата на лумбалния синтаксин-3 са значително по-ниски в групата с WD (67% от контрола), отколкото в двете интактни групи (р 0,05; фиг. 6В). Нивата на BDNF на лумбалното уголемяване са значително по-ниски в групата с WD (65% от контрола), отколкото в двете интактни групи (p 0,05; Фиг. 6C).

Стълбовидни графики, показващи резултати от молекулен анализ на лумбалното уголемяване. A: Нивата на 4-HNE в областта на лумбалното уголемяване са значително по-високи в групата с WD, отколкото както в интактните, така и в DHA-Cur групите (* p 24 От омега-3 мастните киселини, DHA е една от най-използваните клинично и е широко проучен в различни животински модели.Докозахексаеновата киселина е от съществено значение за структурата и функцията на ЦНС, тъй като е важна съставка на фосфолипидите на невронната мембрана. 6, 18 В допълнение, DHA намалява възпалението и подобрява невротрансмисията. 1, 6, 21

Куркуминът е един от основните компоненти на индийската къри подправка куркума и от векове се използва за своите противовъзпалителни и антибактериални свойства. Последните проучвания също демонстрират антиоксидантни свойства и терапевтичните приложения на куркумина в ЦНС са описани при лечението на болестта на Алцхаймер, субарахноидален кръвоизлив 22 и исхемичен инсулт. 14 Както при DHA, невропротективните ефекти на куркумина са изследвани предимно в мозъка, където е доказано, че насърчава нервното възстановяване чрез възстановяване на енергийната хомеостаза, която е критична за синаптичната функция. 23.

Вторично биологично нараняване на цервикалната спондилозна миелопатия и ролята на BDNF

Нашият модел на нараняване намали нивата на BDNF протеин, докато диетичното лечение с DHA-Cur противодейства на тези ефекти. Описаните действия на невротрофините за ограничаване на неврологичното увреждане и подобряване на невронното възстановяване имат потенциално силно приложение при лечението на CSM. Една от основните характеристики на вторичното невронално увреждане при хронична ТСМ е намалената концентрация на критични аксонови растежни фактори, които могат да подобрят функционалното възстановяване на гръбначния кръг. От ключовите фактори на растежа, участващи в невронния ремонт, BDNF демонстрира особено обещание, тъй като е доказано, че има важни роли в регенерацията на аксоните, насърчава оцеляването на невроните, регулира образуването и стабилизацията на синапсите, увеличава дендритната сложност и подобрява синаптичната ефикасност 15 Доказано е също така, че невротрофичният фактор, получен от мозъка, потиска забавената апоптоза на олигодендроцитите след SCI в модел на гризачи. 13 Апоптотичната загуба на олигодендроцитни клетки възниква при еволюцията на CSM и степента на тази загуба корелира със сериозността на неврологичното увреждане. 11 Дори по-важното е, че мощното действие на BDNF за насърчаване на невроналната възбудимост е от решаващо значение за подобряване на невроналната функция и предаването на информация през синапса.

Kasahara et al. 10 прогресивно компресират гръбначните мозъци на плъхове, като поставят тънък разширяващ се полимерен лист под ламината Т-7. Паралелните кохорти бяха подложени на ламинектомия с отстраняване на полимера на 6, 9 и 12 седмици след компресия, бяха евтаназирани и подложени на хистопатологично изследване. В групата с неламинектомия нивата на BDNF протеин бяха повишени 6 седмици след компресията, но намаляха след 12 седмици. Декомпресивната процедура е била ефективна за предотвратяване на загубата на неврони в 6-седмичната група, но не е била ефективна в 9- и 12-седмичните групи. Авторите предполагат, че първоначалното регулиране на експресията на BDNF вероятно е служило като компенсаторен механизъм за защита срещу невронно увреждане и че намаляващото ниво на BDNF може да е един от механизмите на индуцирана от компресия гръбначномозъчна смърт на невроните.

Тези констатации са подкрепени отчасти от Xu et al., 26, които оценяват медиирания от аденовирус BDNF (AdV-BDNF) генен трансфер в и около зоната на механична компресия в модела на хиперостотична мишка twy/twy. Ретроградно доставяне на гръбначен мозък или на AdV-LacZ, или на AdV-BDNF се извършва чрез инжектиране на стерноклеидомастоид, а 4 седмици по-късно се събират горните шийни сегменти и се подлагат на патохистологичен анализ. Имунореактивността към BDNF и броят на оцелелите неврони на предния рог са много по-високи в кохортата AdV-BDNF. Общите резултати изглежда предполагат защитно действие на BDNF, което смекчава ефектите от хроничната SCI.

Хранителни добавки при миелопатия

В настоящото изследване използвахме модел, подобен на този, използван от Kasahara et al. 10 и Kim et al .; 12 поставихме тънък разширяващ се неразбираем полимер, поливинилов алкохол, под гръдната ламина на лабораторни животни, за да предизвика забавена миелопатия с получена неврологична симптоматика. Полимерът се поставя внимателно по атравматичен начин, за да се гарантира, че не се предизвиква остра SCI. Развитието на неврологичния дефицит е свързано главно с нараняването на участъка през стеснения сегмент по време на движение на животните във времето, подобно на етиологията на динамичната миелопатия, срещана при човешки CSM. 5

Обосновката за използването на куркумин и DHA за борба с вторичното биологично увреждане при миелопатия е няколкократна. По-рано показахме, че диетичното лечение с използване на производно на куркумин е довело до повишаване на нивата на BDNF в гръбначния мозък в сравнение с нивата при животни, които не са получавали добавки. 25 Освен това, проучвания in vitro или in vivo показват, че DHA насърчава растежа на невроните на ЦНС, като включва действието на BDNF. 24 По този начин, един от постулираните механизми на невронния ремонт в настоящото проучване е да се използват куркумин и DHA за поддържане на нивата на BDNF в рамките на увредения гръбначен мозък и засилване на неговите ефекти.

Освен това анализирахме увреждането на клетъчната мембрана чрез измерване на нивата на синтаксин-3 в областта на лумбалното уголемяване. Този протеин е локализиран в пресинаптичната плазмена мембрана, която играе решаваща роля в скачването и сливането на везикули по време на повторно отдаване на невротрансмитер. 16 Като се има предвид, че е доказано, че синтаксин-3 е под влиянието на DHA 2 и се намира в зони на синаптични контакти, той е подходящ маркер за оценка на ефектите от нашето диетично лечение върху плазмената мембрана. Съответно, нашите данни демонстрират значително по-висок лумбален синтаксин-3 в групата на DHA-Cur и, заедно с намаляване на липидната пероксидация (4-HNE), показват възможен лечебен ефект върху плазмената мембрана.

Животните, които са получили DHA-Cur, поддържат значително по-високи нива на BDNF на гръбначния мозък, както на нивото на компресия, така и в областта на лумбалното уголемяване, отколкото тези, които не получават хранителни добавки. Въз основа на гореспоменатите изследвания на CSM върху животни и други лабораторни изследвания на BDNF, вероятно е поддържаните нива на BDNF на гръбначния мозък, съчетани с намалено увреждане на клетъчната мембрана, да са критични фактори в запазената неврологична функция, наблюдавана в групата DHA-Cur.

Заключения

Има голяма нужда от разработването на стратегии за невронно възстановяване, които да помогнат за неутрализиране на вторичното биологично увреждане, възникнало по време на неоперативното и оперативното лечение на пациенти с CSM. Диетичните добавки се оказаха успешни при лечението на различни патологични състояния в цялата ЦНС. В животински модел на миелопатия демонстрирахме, че DHA и куркуминът могат да противодействат на ефектите от хроничната компресия на гръбначния мозък чрез няколко молекулярни механизма, което води до запазване на неврологичната функция.