Linh T. N. Nguyen

1 Лаборатория за регулация в метаболизма и поведението, Висше училище по биоресурси и биоекологични науки, Университет Кюшу, Фукуока 819-0395, Япония

сушени

Гуофенг Хан

1 Лаборатория за регулация в метаболизма и поведението, Висше училище по биоресурси и биоекологични науки, Университет Кюшу, Фукуока 819-0395, Япония

Хуей Ян

1 Лаборатория за регулация в метаболизма и поведението, Висше училище по биоресурси и биоекологични науки, Университет Кюшу, Фукуока 819-0395, Япония

Хироми Икеда

1 Лаборатория за регулация в метаболизма и поведението, Висше училище по биоресурси и биоекологични науки, Университет Кюшу, Фукуока 819-0395, Япония

Хатем М. Елтахан

1 Лаборатория за регулация в метаболизма и поведението, Висше училище по биоресурси и биоекологични науки, Университет Кюшу, Фукуока 819-0395, Япония

Vishwajit S. Chowdhury

2 Лаборатория по физиология на стреса и метаболизъм, Отдел за експериментални естествени науки, Факултет по изкуства и наука, Университет Кюшу, Фукуока 819-0395, Япония

Мицухиро Фурусе

1 Лаборатория за регулация в метаболизма и поведението, Висше училище по биоресурси и биоекологични науки, Университет Кюшу, Фукуока 819-0395, Япония

Резюме

Въведение

Телесната температура е важен параметър за оценка на хомеостатичния статус на организма. Околната температура може да повлияе на телесната температура при пилетата. По-специално високите температури на околната среда водят до повишаване на телесната температура и предизвикват топлинен стрес при пилетата (Chowdhury et al., 2012; Ito et al., 2014), тъй като птиците нямат способността да се потят поради липсата на потни жлези (Marder и Arad, 1989; Ensminger et al., 1990). Освен това продължителната висока телесна температура влияе отрицателно на окислителния статус и ефективността на растежа при пилетата (Savory, 1986; Azad et al., 2010; Chowdhury et al., 2014). Следователно намаляването на телесната температура при пилетата е ефективен подход за предпазването им от потенциално неблагоприятните ефекти на топлинния стрес.

l-цитрулин (l-цит) е ендогенна аминокиселина в повечето живи системи (Curis et al., 2005). Това е непротеинова аминокиселина (Angela et al., 2011), която се метаболизира до l -аргинин (l-Arg), който след това се превръща в l -орнитин (l-Orn) от аргиназа (Tamir and Ratner, 1963; Suenaga et al., 2008). Наскоро беше установено, че плазмените l -Cit нива са значително намалени от топлинния стрес при пилетата (Chowdhury et al., 2014). Интересното е, че се съобщава също така, че оралното приложение на l -Cit, но не и на l -Arg или l -Orn, понижава телесната температура при пилетата (Chowdhury et al., 2015) и осигурява степен на термотолерантност (Chowdhury et al., 2017 ). Следователно предоставянето на l-Cit може да предложи ново хранително средство за намаляване на телесната температура при пилетата при топлинен стрес. Въпреки че включването на синтетичен l-Cit в дажбите за птици все още не е одобрено (Център за инспекция на храните и земеделските материали, Япония, 1953 г.), алтернативен подход може да бъде използването на естествен източник на l-Cit, който може да предложи средство за увеличаване на плазменото съдържание на l-Cit при пилетата за подобряване на ефектите от топлинен стрес и подобряване на производството на птици.

l -Cit е идентифициран за първи път като съставна част на динята (Citrullus vulgaris) в началото на ХХ век (Koga и Ohtake, 1914; Wada, 1930), а динята се смята за естествен източник на l -Cit (Rimando и Perkins- Veazie, 2005; Tarazona-Díaz et al., 2011). Интересното е, че динената кора (WR), селскостопански отпадъчен продукт, съдържа голямо количество l-Cit в сравнение с плътта му (Rimando and Perkins-Veazie, 2005). След абсорбцията на l -Cit от диня е установено, че нивата на l -Arg в плазмата се увеличават при хората (Mandel et al., 2005; Collins et al., 2007). Доказано е, че консумацията на диня, комбинирана с упражнения, намалява артериалното кръвно налягане в сравнение с плацебо (Figueroa et al., 2011). По този начин има индикации, че l-Cit в сок от диня може да повлияе на физиологичните функции. Доколкото ни е известно, ефектът от използването на WR като естествен източник на l-Cit върху плазмените l -Cit нива или телесни температури не е проучен при нито един вид.

В настоящото проучване бяха изследвани химическият състав и съдържанието на свободни аминокиселини в WR сух прах (WRP). Освен това бяха изследвани ефектите на WR върху нивото на l -Cit в плазмата и телесната температура при пилетата. Пилешката кръв беше анализирана за оценка на плазмените нива на l-Cit и други концентрации на свободни аминокиселини след продължително хранене с диета, допълнена с WRP.

Материали и методи

Животни

Еднодневни пилета от мъжки слой (щам Julia; Gallus gallus domesticus) са закупени от местна люпилня (люпилня Murata, Фукуока, Япония) и настанени заедно в метални клетки (50 × 35 × 33 см) в група (14 птици) в постоянна температура от 30 ± 1 ° C с непрекъсната светлина. Пилетата са имали свободен достъп до храна [Настройте диетите (метаболизираща енергия (ME):> 12,55 MJ/kg, протеини:> 23%); Toyohashi Feed и MillsCo. Ltd., Aichi, Япония] и вода през целия експериментален период. Това проучване е проведено в съответствие с насоките за експерименти с животни на Аграрния факултет и на аспирантурата на университета в Кюшу и се придържа към Закон №. 105 и Notification No. 6 от японското правителство.

Подготовка на WRP Mash

Пресни дини са получени от Suika-no-Meisan, (Кумамото, Япония). Кората се отделя от месото и се суши във фурна (Matsui MFG CO., Ltd., Япония) при 60 ° С в продължение на 96 часа. След пълно изсъхване WR се смила за 1 минута с помощта на електрическа мелница [Wonder blender (KT.WB-1), Kastech, Япония], за да се получи WRP. WRP се съхранява в херметически затворени пластмасови торбички при стайна температура, докато не се използва в експериментите. За да се получи WRP каша диета, 100 g WRP се смесва със 125 ml деионизирана дестилирана вода. След това WRP кашата (225 g) се смесва с търговска стартова диета (900 g), за да се получи 9% WRP каша. Тъй като максимално препоръчителното ниво на фуражни добавки в храните за птици е 15% (Banerjee, 1998), използваното тук ниво на добавки е относително ниско.

Приблизителен анализ на WRP

Химичният състав на WRP е анализиран от Японския център за функционален анализ и изследване на храните (Fukuoka, Япония). Определяха се съдържанието на влага, суров протеин, етерен екстракт, сурови влакна и пепел. Накратко, влагата се определя чрез загуба на тегло при нагряване при 135 ° С в продължение на 2 часа. Методът на Kjeldahl е приложен за измерване на суров протеин. За анализ на сурови мазнини са използвани методи на хидролиза и екстракция с етер. Анализът на суровите влакна се извършва с използване на H2SO4 и NaOH. Пепелта се определя чрез директно изпичане на WRP при 600 ° С в продължение на 2 часа.

Анализ на концентрациите на свободни аминокиселини в WRP

Експериментален дизайн

Общо 14 пилета (на 2 дни) бяха разделени постепенно на групи от по 2 пилета на клетка (21 × 10 × 14 cm); 3-дневните пилета бяха изолирани индивидуално в две групи (n = 7). Използвахме постепенна изолация (1-ви ден, 14 пилета/клетка; 2-ри ден, 2 пилета/клетка; и 3-ти ден, 1 пиле/клетка), за да отделим пилетата поотделно, за да сведем до минимум изолационния стрес. Стартерната диета е заменена с 9% WRP каша диета в лечебната група, докато контролната група е продължила стартерната диета по време на експерименталния период, от 3 до 15 дни. Извършва се ежедневно регистриране на приема на храна, телесно тегло и ректална температура. Ректалната температура беше измерена с цифров термометър с точност до ± 0,1 ° C (Thermalert TH-5, Physitemp Instruments Inc., САЩ) чрез вкарване на сондата на термистора в ректума през клоаката на дълбочина около 2 cm от ануса . В края на експеримента птиците бяха евтаназирани чрез излагане на изофлуран (Mylan Inc., Токио, Япония). Кръвта веднага се събира от вратната вена в хепаринизирани епруветки и се центрофугира при 10 000 × g в продължение на 4 минути при 4 ° C (MX-307, Tommy, Япония), за да се събере плазма. Плазмата се съхранява при -80 ° C, докато се извърши анализ на свободните аминокиселини.

Анализ на концентрациите на свободни аминокиселини в плазмата

Концентрациите на свободни аминокиселини се анализират чрез UPLC съгласно метода на Ohmori et al. (2011) с някои модификации. Плазмата се получава чрез центрофугиране при 14 000 × g за 15 минути при 4 ° С (MX-307, Tommy, Япония). След това плазмата се филтрира през ултрафилтрационни епруветки (Millipore, Bedford, USA). Проби (10 µl) плазма се прехвърлят в UPLC епруветки и се добавят и се смесват 20 µl N-ацетилцистеин/офталалдехид и 70 µl боратен буфер; епруветките се оставят за 2 минути в тъмна стая. Пробите и стандартите бяха приложени към UPLC, както е описано по-горе за анализа на WRP. Концентрациите на аминокиселини в плазмата са изразени в nmol/ul.

Статистически анализ

Промените в приема на храна, телесното тегло и ректалната температура бяха статистически анализирани чрез двупосочен ANOVA, където основните ефекти бяха лечението с WRP и дни/време. Безплазмените аминокиселини се анализират чрез t-тест на Student. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на софтуера StatView Версия 5.0 (SAS Institute, Cary, NC, USA, 1998). Стойностите са представени като средни стойности ± S.E.M.

Резултати

Резултатите от химичния анализ на WRP са представени в таблица 1, а съдържанието на свободни аминокиселини - в таблица 2. l -Cit (18,2 nmol/mg или 3,18 mg/g) е най-разпространената свободна аминокиселина в WRP, а l-Arg е следващата по разпространение (2,72 nmol/mg) (Таблица 2). Концентрациите на l -аланин, l -глутамин, l-валин, l-фенилаланин, l-изолевцин, l-серин, l-тирозин и GABA също са показани в таблица 2 .