Резюме

Заден план

Въпреки че метаболитната асоциирана мастна чернодробна болест (MAFLD) се свързва със затлъстяването, тя може да се появи и при слаби пациенти. MAFLD е по-агресивен при слаби пациенти в сравнение с пациенти със затлъстяване, с по-висок риск от смъртност. Липсват специфични биомаркери за диагностициране на диференциално постно или с наднормено тегло MAFLD. Хистоните и нуклеозомите се освобождават в кръвта след клетъчна смърт. Тук ние предлагаме нов, бърз подход, основан на изображения и епигенетика, за да се изследва тежестта на стеатозата при слаби пациенти с МЗХБЛ.

Резултати

Наети са общо 53 пациенти със затлъстяване с хистологично потвърдена диагноза МАГХБ. Двадесет пациенти показаха степен на стеатоза 1 степен (0–33%), 24 пациенти със степен 2 на стеатоза (34–66%) и 9 пациенти със степен 3 на стеатоза (67–100%). Нивата на циркулиращите нуклеозоми бяха анализирани с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ, докато отделни хистони или хистонови димери бяха изследвани в серумни проби с помощта на нов усъвършенстван метод, адаптиран към поточната цитометрия ImageStream (X). Циркулиращите нуклеозомни нива се свързват зле с MAFLD при липса на затлъстяване. Приложихме успешно многоканална методология на потока в ImageStream (X), за да изобразим оцветяване с единичен хистон (H2A, H2B, H3, H4, macroH2A1.1 и macroH2A1.2). Тук отчитаме значително изчерпване на нивата на хистоновите варианти macroH2A1.1 и macroH2A1.2 в серума на постно болни от MAFLD, поотделно или в комплекс с H2B.

Заключения

В обобщение, идентифицирахме нов циркулиращ хистонов подпис, способен да различи тежестта на стеатозата при лица с постно MAFLD, използвайки бърза и неинвазивна технология за изображения, базирана на ImageStream (X).

Заден план

Резултати

Лошо свързване на серумни нива на нуклеозоми и пациенти със затлъстяване с MAFLD

Наскоро демонстрирахме, че нивата на циркулиращи нуклеозоми се свързват силно с MAFLD, предизвикано от затлъстяване, както е определено чрез ELISA анализ [15]. Тук се опитахме да определим дали циркулиращите нива на нуклеозоми се свързват с MAFLD сред пациенти със затлъстяване. За тази цел от амбулаторната клиника бяха наети общо 53 пациенти с постно тегло или с наднормено тегло с доказана биопсия MAFLD [33] и сравнени с лица със затлъстяване или затлъстяване с FLI 4) резултат от NAS, представляващ сумата от точки за стеатоза, лобуларно възпаление и балониране и вариращи от 0–8 [33]) (Таблица 2). Изненадващо не успяхме да намерим връзка между нивата на циркулиращите нуклеозоми и степента на стеатоза, от S1 до S3, при пациенти със затлъстяване (постно + наднормено тегло) (фиг. 2а) и при пациенти с наднормено тегло (фиг. 2б), докато при слаби пациенти а значително увеличение (стр = 0,018) е открит при S3 срещу S1 индивиди (фиг. 2в). По същия начин не е очевидна разлика в нивата на циркулиращи нуклеозоми според диагнозата NASH (Фиг. 2d-f). Като цяло тези данни показват, че нивата на серумни нуклеозоми не са универсални маркери на MAFLD и NASH при липса на затлъстяване.

свързано

Оптимизация на ImageStream (X) за откриване на циркулиращи хистонови и хистонови комплекси

Представителни изображения, разпределение на размера и интензивност на сигнала на флуоресценция от Alexa Fluor® 488 на три вида циркулиращи обекти (а-i) и клетки (к-м) положителен за експресия на H2A. Снимките на ImageStream показват изображения с ярко поле и оцветяване с H2A (флуоресценция от Alexa Fluor® 488)

Представителни изображения, разпределение на размера и интензивност на сигнала на флуоресценция от Alexa Fluor® 488 на рекомбинантни ядрени хистони H2A (а-° С), рекомбинантни ядрени хистони H4 (д-е) и човешки естествен нуклеозомен протеин (ж-i) положително за експресия на H2A (H4). Снимките на ImageStream показват изображения с ярко поле и оцветяване с H2A (H4) (флуоресценция от Alexa Fluor® 488)

Циркулиращите макро H2A1.2, H2B и H4 хистони отбелязват тежестта на човешкото постно безалкохолно мастно чернодробно заболяване

Представителни изображения, разпределение на размера и интензивност на сигнала на флуоресценция от флуоресцентен маркер на канонични хистони (H2A, H2B, H3, H4) и 2 големи варианта на хистон H2A (macroH2A1.1 и macroH2A1.2). Снимките на ImageStream показват изображения с ярко поле и оцветяване с хистон (флуоресценция от Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 549, Alexa Fluor® 594 или Alexa Fluor® 647)

Представителни изображения, разпределение на размера и интензивност на сигнала на флуоресценция от Alexa Fluor® 488 и Alexa Fluor® 594 за многоканално откриване на макроH2A1.2/H2B хистон. Снимките на ImageStream показват изображения в ярко поле, оцветяване с хистон на macroH2A1.2 (флуоресценция от Alexa Fluor® 488), оцветяване с H2B с хистон (флуоресценция от Alexa Fluor® 594) и композитни изображения, наслагвания на оцветяване с macroH2A1.2 и H2B.

Дискусия

Изоформите на MacroH2A1.1 и macroH2A1.2 произхождат от алтернативно сплайсиране на macroH2A1. MacroH2A1.1 макродомейнът специфично свързва никотинамид аденин динуклеотид (NAD +) - производни метаболити като ADP-рибоза и O-ацетил-ADP-рибоза: това свързване на ADP-рибоза дава възможност на macroH2A1.1 да взаимодейства с активиран PARP1 ензим [42]. От друга страна, изоформите на macroH2A1.2 и macroH2A2 не са в състояние да свързват тези метаболити [42].

Ролята на метаболизма на ADP-рибоза в метаболитната регулация и натрупването на липиди в периферните тъкани става все по-ценена [43]: нивата на циркулиращи макроН2А1.1/макроН2А1.2 могат да отразяват метаболизма на ADP-рибоза в черната и мастната тъкан. Ранните проучвания при мишки показват, че локализацията на macroH2A1 е обогатена в телата на гените, функционално групирани в областта на липидния метаболизъм [44] и изкуствено манипулиране на експресията на изоформа macroH2A1 влияе върху натрупването на липиди в клетките [45]. Остава да бъде установено потенциално взаимодействие между изоформите на macroH2A1 и гените за метаболизъм на липидите, участващи в постно MAFLD (CETP, PEMT, PNPLA3) [7, 46].

Смята се, че непокътнатите нуклеозоми се освобождават чрез умиращи неутрофили или от техните неутрофилни извънклетъчни капани (NET), както наскоро бе потвърдено от автоматизиран тръбопровод, базиран на ImageStream (X), позволяващ количествено определяне на NET в стимулирани циркулиращи човешки неутрофили [47]. Използвайки ELISA тестове, ние показахме, че непокътнатите нуклеозоми са силни маркери на свързаната със затлъстяването MAFLD [15], но не и на постната MAFLD или NASH. Вероятно обяснение е, че броят на неутрофилите при пациенти с MAFLD корелира с BMI с наднормено тегло/затлъстяване MAFLD е съобщено, че е по-голям в сравнение с постно MAFLD [48, 49]. Чернодробната неутрофилна инфилтрация е отличителен белег на NASH и се смята, че е свързана с увреждане на черния дроб и прогресиране на заболяването, като генерира реактивни кислородни видове и произвежда провъзпалителни медиатори [50]; това явление обаче може да остане локализирано и да не доведе до NET-зависимо детектируемо увеличение на серумните нуклеозоми.

Силните страни на нашето проучване разчитат на (i) доказаната с биопсия диагноза MAFLD, която позволява хистологично валидиране на клиничния фенотип и корелации с нивата на хистона, без съмнение и (ii) установяването на икономически ефективен, бърз образен протокол, изискващ минимални количества серум/кръв. Нашето проучване има и някои ограничения, които включват ниския размер на извадката, особено за анализа, базиран на ImageStream (X). Всъщност сравнението на нивата на хистон е проведено при ограничен размер на пробата (т.е. 9 пациенти на група със степен на стеатоза), което е достатъчно за откриване на 70% промяна в нивата на хистон. Следователно, нашият анализ не успя да открие малка разлика между пациентите със стеатоза степен 1 ​​и степен 3. Същото сравнение, стратифицирано по категории на ИТМ, трябва да се тълкува с повишено внимание още повече и следователно следва да се насърчават по-нататъшни мащабни проучвания, за да потвърдят нашите обещаващи резултати. По същата причина ограниченият размер на извадката не ни позволи да вземем предвид допълнителните ковариати. Въпреки че частично се справихме с този проблем, като съпоставихме двете групи по възраст, пол и ИТМ, ефектът от други клинични и лични характеристики трябва да бъде разгледан при по-нататъшни изследвания.

В действителност остава да се установи въздействието на многоболестта, често срещана при индивиди, страдащи от затлъстяване и метаболитен синдром, върху състава на циркулиращия хистонов комплекс: необходим е по-голям размер на пробата, за да се определи връзката между циркулиращите хистони, MAFLD при пациенти със затлъстяване.

В обобщение, ние идентифицирахме чрез нов методологичен подход ImageStream (X) циркулиращ хистонов подпис, който, ако бъде потвърден в по-големи и независими кохорти с различен етнически произход и възраст, може да бъде полезен за диагностициране на тежестта на стеатозата при лица с постно MAFLD. С този подход циркулиращите хистонови комплекси могат да бъдат удобно и изчерпателно изследвани, като по този начин се предлагат нови фенотипни и функционални прозрения за уникална МЗХГ, възникващи при слаби индивиди.

Методи

Проучвайте популация

Общо 53 пациенти с наднормено тегло, свързани с метаболитни чернодробни заболявания (MAFLD), бяха наети от амбулаторията за чернодробни заболявания в Католическия университет на Свещеното сърце на Рим. Индексът на телесна маса (ИТМ) се изчислява като тегло (kg)/височина 2 (m). Обиколката на талията се измерва със стандартни процедури. Аланин трансаминазата (ALT), аспартат трансаминазата (AST), триглицеридите, общият липопротеин с висока плътност (HDL) и холестеролът на липопротеините с ниска плътност (LDL) са измерени по стандартни лабораторни методи. Глюкозата на гладно и инсулинът на гладно също се оценяват чрез автоматизирани търговски методи. IR се оценява чрез оценка на хомеостатичния модел (HOMA) [HOMA-IR = (инсулин (μIU/ml) × глюкоза (mmol/l))/22,5)]. Граничната стойност> 2,5 се счита за индекс на IR [51].

Точкуването на чернодробни биопсии се извършва от независими патолози, които не знаят за състоянието на пациента. Възрастни пациенти с хистологично потвърдена диагноза MAFLD [33], с наднормено тегло, но без затлъстяване, бяха избрани, както следва: 21 пациенти със стеатоза степен 1 ​​(0–33%), 24 пациенти със стеатоза степен 2 (34–66%) и 9 пациенти със стеатоза степен 3 (67–100%). Всички други причини за увреждане на черния дроб, различни от натрупването на липиди, бяха изключени. Всички пациенти са били отрицателни за серологичните маркери на хепатит В и хепатит С, са имали ниво на консумация на алкохол

Наличност на данни и материали

Наборите от данни, използвани и/или анализирани по време на настоящото проучване, са достъпни от съответния автор при разумна заявка.