РЕЗЮМЕ

ВЪВЕДЕНИЕ

Някои организми са в състояние да преживеят почти пълната загуба на вътрешната си вода, влизайки в състояние на суспендирана анимация, наречена анхидробиоза. Когато водата стане отново достъпна, организмът се съживява и възобновява нормалните си дейности. Тези организми са наречени „спящи красавици“, тъй като изглежда не стареят по време на покой (Hengherr et al., 2008; Ricci and Covino, 2005). Толерантността към изсушаване е относително широко разпространена сред прокариотите и едноклетъчните еукариоти [напр. хлебна мая, Saccharomyces cerevisiae (Potts, 1994)], но е по-рядко срещана при многоклетъчни еукариоти, като е изключителна за някои етапи от живота на растенията (главно семена и цветен прашец), редица растения за възкресение и някои безгръбначни, с добре известни примери сред членестоногите, тардиградите, нематодите и бделоидните ротифери (Alpert, 2006; Clegg, 2001).

чужди

При някои организми повишаването на нивата на ди- и олигозахаридите, особено нередуциращите захари трехалоза (при животните) и захарозата (при растенията), е свързано със способността да оцеляват при изсушаване (Crowe et al., 1998; Hoekstra и др., 2001). Например, анхидробиотичната ларва на хирономида Polypedilum vanderplanki натрупва ~ 18% трехалоза от сухо тегло, тъй като губи вода, а нивото на трехалоза корелира с вариацията в оцеляването сред индивидите (Watanabe et al., 2002). Такива корелации, заедно с мощните стабилизиращи свойства на трехалозата in vitro (Colaco et al., 1992), доведоха до модели на анхидробиоза, в които нередуциращите дизахариди играят централна роля и най-често се предлага заместване на вода или витрификация функции (Crowe et al., 1998; Crowe et al., 1992). Това обаче не е цялата история (Tunnacliffe and Lapinski, 2003): bdelloid rotifers, например, не съдържат трехалоза и очевидно им липсват гените, които да я синтезират (Caprioli et al., 2004; Lapinski and Tunnacliffe, 2003). При дрождите S. cerevisiae, чийто толеранс към изсушаване е добре атестиран, синтезът на трехалоза може да бъде премахнат чрез мутация само с умерено намаляване на преживяемостта (Ratnakumar and Tunnacliffe, 2006).

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Поддръжка на ротифер

Бделоидният ротифер Adineta ricciae Segers and Shiel, 2005 (известен преди като Adineta sp. 1) е използван като модел за изследване на генната регулация в устойчив на изсушаване организъм. Клоналните култури на A. ricciae се поддържат в пластмасови бутилки или колби; използвахме или пластмасови ролкови бутилки (Corning Life Sciences, Амстердам, Холандия), поддържани хоризонтално, за да увеличим максимално съотношението повърхност/обем, с около 300 ml вода с автоклавирана ултра висока чистота (UHP), или колби за клетъчни култури (между 35 и 175 cm 2, с филтърни капачки) (Nunc, Roskilde, Дания) с 12–200 ml същата вода. Ротиферите се държат при 22 ° C и се хранят веднъж на 1–3 дни с RAGO (Rotifer и Artemia GrowOut; www.aquaculturesupplies.co.uk: 15 gl –1 основен разтвор, приготвен във вода, автоклавиран и оставен да се охлади и утайка; супернатанта се използва за хранене) или Escherichia coli [отглежда се в среда от бульон Luria (LB) за една нощ, възстановява се чрез центрофугиране и се суспендира отново в автоклавирана UHP вода]. И двете суровини се съхраняват замразени и се държат при 4 ° C в продължение на няколко дни по време на употреба.

Rotifer изсушаване

По-рано е доказано, че A. ricciae преживява изсушаване със скорости до ~ 80% (Ricci et al., 2004; Ricci and Covino, 2005) и подобни проценти на оцеляване се наблюдават в нашите ръце, в зависимост от използвания протокол за сушене. Ротификаторите, които трябва да бъдат изсушени, се събират чрез филтриране: контейнерът се разклаща няколко пъти, за да се отделят ротифери, след това суспензията на ротифера се филтрира през 20 μm или 5 μm Nitex филтри (Sefar, Heiden, Швейцария). Животните, събрани на филтри, бяха изсушени съгласно един от трите различни протокола за сушене (Ricci et al., 2003). За първите два метода беше използвана камера за изпитване на околната среда (Temperature Applied Sciences Ltd., Goring, UK), където може да се контролира температурата и относителната влажност (RH). В първия протокол, Ricci B, RH намалява от 98% на 40% за 15 h, след което се поддържа при 40% RH за още 153 h; във втория протокол, Ricci C, RH се поддържа на 98% RH за 72 часа. В третия протокол, който беше използван за абсолютна количествена оценка на mRNA на шест гена, филтърът беше поставен между две хартии Whatman, напоени с 1 ml UHP вода в автоклав и оставен запечатан при стайна температура за 24 h (RH ∼100%); след това чашата на Петри се отваря и се оставя за 48 h, докато филтърът се уравновеси с околната влажност (~ 33% RH). Контролни, несъхнали ротифери също се събират на филтри, но РНК се екстрахира незабавно.

Екстракция на РНК

РНК се екстрахира с помощта на TRIzol реагент (Invitrogen, Paisley, UK) съгласно протокола на производителя, измива се с етанол и се суспендира отново в обработена с диетилпирокарбонат вода. Концентрацията на РНК се измерва със спектрофотометър NanoDrop (ND-1000) (Thermo Fisher Scientific, Loughborough, UK) и качеството се оценява чрез анализ на спектрите на абсорбция и съотношенията A260/280 и A260/230.

Изграждане на библиотека EST

Биоинформатика и анализ на последователността

ДНК последователностите от библиотеката за изваждане бяха анализирани с различни софтуерни пакети: 4Peaks (версия 1.7.2, www.mekentosj.com), ApE (A плазмиден редактор, версия 1.17, http://www.biology.utah.edu/jorgensen/ wayned/ape) и Geneious Pro (версия 4.8.4, www.geneious.com). Неуспешните последователности (например последователности с неразличими пикове или с множество/припокриващи се показания) бяха изхвърлени на този етап и одобрените последователности бяха анализирани с blastx (Altschul et al., 1990) (blastx версии 2.2.21–2.2.23, не-излишни база данни за протеини). Допълнителен анализ на избрани ESTs беше извършен с tblastx.

Последователностите с Е-стойност по-ниска от E-05 при търсенето на blastx се считат за определени хитове, докато последователности с Е-стойност по-висока от E-05 се смятат за нови. В първия случай последователностите бяха присвоени на една от 10 функционални категории. Когато не е намерено съвпадение с blastx, шестте възможни отворени рамки за четене (ORF) са получени с Geneious Pro и най-дългият е анализиран допълнително. Физико-химичните характеристики бяха изведени с различни софтуерни пакети. Присъствието на сплайсиран лидер, открит в 5 ′ края на част от bdelloid mRNAs (Pouchkina-Stantcheva and Tunnacliffe, 2005), и поли (А) последователности на опашката беше определено с Geneious; хидрофилността е оценена с помощта на ExPASy ProtScale (http://www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl); теоретичен pI, брой заредени остатъци, GRAVY индекс (средностатистическа хидропатия) и съдържание на глицин бяха изчислени с инструмента ExPASy ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html); прогнози за разстройства бяха извършени в PONDR (Predictors of Natural Disordered Regions; http://www.pondr.com), използвайки Uversky plot, VL-TX и VL3 алгоритми (Li et al., 1999; Radivojac et al., 2003), и с FoldIndex (Prilusky et al., 2005) (http://bip.weizmann.ac.il/fldbin/findex).

Филогенетичен анализ

За да се подкрепи чуждестранният произход на някои EST, бяха извършени филогенетични анализи с помощта на Geneious. ORFs бяха анализирани с blastp и аминокиселинните последователности, съответстващи на десетте най-добри съвпадения на видовете, бяха изтеглени и подравнени с ClustalW, и беше построено дърво за присъединяване на съседи (генетичен модел на Jukes-Cantor; без априори да се посочва извън група) Поддръжката на Bootstrap беше изчислена с 1000 повторения, а таксоните бяха цветно кодирани в дървото на консенсуса. Последователностите бяха елиминирани, когато дълги клонове караха всички други клонове да се срутват.

Количествена PCR

Профилът на генна експресия преди и след дехидратацията обикновено се изследва чрез относителна количествена PCR в реално време (qPCR), нормализираща генната експресия спрямо референтен ген, чието ниво на експресия се очаква да остане постоянно или почти така (или актин, или 18S, или и двете). Шаблонна кДНК е получена, както е описано по-горе, и всички PCR се изпълняват в RotorGene 3000, като се използва SYBR-Green PCR комплект (Qiagen). В редица случаи абсолютното количествено определяне беше извършено със същия инструмент, като се използва RT-qPCR в реално време комплект (Qiagen), както е описано по-рано (Browne et al., 2004). В този случай плазмидна ДНК от бактериални запаси беше извлечена с midi-prep kit (Qiagen), количествено определена чрез ултравиолетова абсорбция със спектрофотометър NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific), транскрибирана с MEGAscript Kit (Applied Biosystems/Ambion, Warrington, Великобритания), съгласно инструкциите на производителя, използвайки или T7 или SP6 полимераза в зависимост от ориентацията на фрагмента и общия брой целеви молекули, количествено определени чрез серийно разреждане (обикновено в диапазона от 0,001–1000 ng μl –1).

РЕЗУЛТАТИ

EST библиотека от гени, реагиращи на дехидратация

Bdelloid rotifers изискват бавна скорост на изсъхване за максимална преживяемост (Lapinski and Tunnacliffe, 2003; Ricci et al., 2003) и поради това разсъждаваме, че редица метаболитни адаптации трябва да бъдат активирани за успешна анхидробиоза при тези безгръбначни. За да се опитаме да идентифицираме адаптации, регулирани на ниво транскрипция, генерирахме EST библиотека, обогатена за последователности, които са свръхпредставени в bdelloid transcriptome след 24 h десикация в сравнение с несъхналите контроли. Първоначалните 93 четливи последователности бяха допълнително анализирани за възможни дубликати, връщайки общо 75 уникални предполагаеми кандидати, които след това бяха сравнени с известни последователности с помощта на инструмента за търсене BLAST. Blastx върна 36 последователности със значително съвпадение в базите данни (изброени в таблица 1) и включи останалите 39 EST като нови последователности (оценка на най-близко съвпадение> E-05). От тях осем EST (F24-15, F24-19, F24-26, F24-31, F24-38, F24-54, F24-91 и F24-98; номера за присъединяване HO188837, HO188839, HO188841, HO188843, HO188845, HO188853, HO188864 и HO188866, съответно) не показват никакви ясни ORF (≥50 аминокиселини) и следователно бяха изключени от по-нататъшни анализи; останалите 31 EST са изброени в таблица 2. Три от последователностите без ясни ORF (F24-15, F24-38 и F24-98) са включени в проучвания на профила на експресия (виж по-долу).

Изразени маркери за последователност (EST) от A. ricciae със значителни съвпадения в базата данни; в 10 функционални категории

Анализ на отворени рамки за четене (ORF) от изразени етикети на последователност (EST) без значителни съвпадения на база данни чрез blastx анализ; т.е. „нови“ последователности

EST със съвпадения в базата данни включват чужди гени

Изразени етикети на последователността от гени на A. ricciae, потенциално възникващи от хоризонтален трансфер на ген

За останалите четири EST обаче резултатите от tblastx поддържат екзогенен произход за съответните гени. F24-2, чиято последователност показва сходство с глюкозо-репресируеми гени с неизвестна функция, не дава резултати с Е-стойност 9.0). По този начин, осем от 31, или 26%, нови последователности вероятно ще бъдат хидрофилни IDPs или поне да съдържат вътрешно неподредени области (IDR). С по-строг подход, изискващ да бъдат изпълнени три от четирите критерия за разстройство, три EST (F24-49, F24-82, F24-106) бяха изхвърлени (светлосиво засенчване в таблица 2), оставяйки пет от 31, или 16%, като хидрофилни ВРЛ. От набора от данни за EST като цяло (общо 67 EST, с изключение на осемте EST без разпознаваем ORF), хидрофилните ВРЛ съставляват съответно 12% или 7%, в зависимост от използваните критерии за подбор. Това е в границите на стойностите за представяне на IDP в протеамите на еукариот (Dunker et al., 2000; Tompa, 2009) и следователно предполага, че такива протеини не са прекалено представени в bdelloid rotifer. Идентифицираните вътрешно разселени лица не съдържат висок дял глицин и следователно не отговарят на определението за „хидрофилини“ (Garay-Arroyo et al., 2000), където е предвидено минимум 6% глицин.

Филогенетично дърво за F24-20, предполагаем основен протеин/глюконолактоназа от пчелно млечице. Съседно присъединяващо се дърво на консенсус с поддръжка на bootstrap след 1000 повторения (поддръжката на bootstrap е посочена само за основните клонове). Taxa са кодирани с цвят: черно, метазоани; розово, гъбички; синьо, бактерии; сиво, друго. Етикетът с изразена последователност F24-20 е в червено. Скалата показва броя на заместванията на аминокиселини на място.

Профили на генна експресия

ДИСКУСИЯ

Генна регулация на A. ricciae при различни режими на сушене. Изразените етикети на последователността са изброени на оста y, разделени на групи категории, а регулирането на сгъването е показано на оста x (дневна скала). Непрекъснатата вертикална линия показва липса на промяна в нивото на транскрипция, а фланговите пунктирани линии представляват съответно 0,5- и 2-кратно регулиране; стойностите в тези граници се считат, че не представляват никаква или пределна регулация. Символите показват различни протоколи за изсушаване (червено, Ricci B; синьо, Ricci C; зелено, изсушаване в чаша на Петри - изсушено на въздух) и вида на използвания qPCR (кръгове, относително количествено определяне; триъгълници, абсолютно количествено определяне). За да се улесни сравнението на точките с данни, различни стойности за един и същ ген са свързани с хоризонтална линия. EST, произтичащи от чужди гени, са очертани с ясен черен квадрат (както е изброено в таблица 3); „Новите“ хидрофилни и вътрешно неподредени протеинови EST са засенчени в тъмно сиво или светло сиво според повече или по-малко строги критерии за тяхната идентификация (вж. Таблица 2).

Наличието само на един тип LEA протеинова последователност в набора от данни EST ни накара да търсим други видове неструктурирани хидрофилни протеини, които могат да имат аналогична роля в толерантността към изсушаване. Не намерихме пример за „хидрофилин“ (Garay-Arroyo et al., 2000), т.е. както с висока хидрофилност, така и с високо съдържание на глицин, но открихме кандидат-хидрофилни ВРЛ, които споделят някои физико-химични характеристики с LEA протеини. От петте най-силни кандидати, трима са регулирани нагоре по време на загубата на изпарителна вода и по този начин участват в реакцията на стрес при изсушаване. В допълнение, поне 12 други нови последователности също постоянно се регулират чрез дехидратация; тъй като функцията на тези гени е напълно неизвестна, те представляват интересна възможност за по-нататъшни изследвания.

ПРИЗНАВАНИЯ

Благодарим на проф. Тим Бараклоу (Империал колеж, Лондон) и д-р Естер Лубенс (Израелски океанографски и лимнологични изследвания) за полезни коментари по ръкописа.

СТЪПКИ

↵ * Настоящ адрес: 712 Дарвин център, Отдел по зоология, Природонаучният музей, Cromwell Road, Лондон SW7 5BD, Великобритания