Субекти

Резюме

Безалкохолният мастен черен дроб (NAFL) е предшественик на неалкохолен стеатохепатит (NASH), състояние, което може да прогресира до цироза и хепатоцелуларен карцином. Все още липсват маркери за диагностика на NASH. Ние изследвахме липидни маркери, използвайки модели на мишки, които развиха NAFL, когато се хранят с диета с високо съдържание на мазнини (HFD) или NASH, когато се хранят с диета с дефицит на метионин холин (MCDD). Извършихме цялостен липидомичен анализ върху чернодробни тъкани, както и върху серуми от мишки, хранени с HFD (n = 5), MCDD (n = 5) или нормална диета като контроли (n = 10). Подходът за машинно обучение, основан на анализ на прогнозирането на микрочипове, последван от произволни гори, позволи да се идентифицират 21 липида от 149 в черния дроб и 14 липида от 155 в серумно-дискриминиращи мишки, хранени с MCDD от HFD или контрола. В заключение, прилаганият глобален подход позволи да се характеризират липидните подписи, специфични за NASH, както в черния дроб, така и в серума от животински модели. Това отваря нов път за изследване на ранни и неинвазивни липидни маркери за диагностика на NASH при хора.

Въведение

Безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD) е патологично състояние, показващо широк спектър от лезии от неалкохолен мастен черен дроб (NAFL) до неалкохолен стеатохепатит (NASH). Установено е, че NASH може да прогресира до чернодробна фиброза, цироза и хепатоцелуларен карцином 1,2,3. NAFLD е системно заболяване, свързано със затлъстяване, инсулинова резистентност, захарен диабет тип 2 и метаболитен синдром 4,5,6,7. Драматичното нарастване на такива случаи, което в момента над 1 милиард индивида, прави NAFLD най-честата причина за хронични чернодробни заболявания и основен проблем на общественото здраве в световен мащаб .

Отличителният белег на мастната чернодробна болест е вътреклетъчното натрупване на липиди, което води до образуването на липидни капчици в хепатоцити. Това натрупване е резултат от дисбаланс между усвояването, синтеза, износа и окисляването на мастни киселини 4,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Тъй като не всички липиди са създадени еднакво, напоследък при търсенето на маркери на NASH бяха проведени изчерпателни липидомични изследвания от чернодробни биопсии или серуми, използващи човешки проби или модели на мишки 12,23,24,25,26,27. Тези проучвания разкриват промени в хомеостазата на някои липиди по време на прогресията на NASH. Нито едно от тези проучвания обаче не успя да характеризира специфичен липиден подпис на NASH поради липсата на подходящи статистически процедури.

В това проучване използвахме добре утвърдени диетични миши модели на NAFL и NASH. Ние внедрихме подход, основан на цялостен липидомичен анализ, последван от анализ на данните от учебната машина, и потвърдихме тези резултати чрез ненаблюдаван клъстер анализ. Този оригинален анализ на данни е идентифицирал липидни сигнатури както в черния дроб, така и в серума, специфични за NASH.

Резултати

Характеризиране на животински модели на безалкохолен мастен черен дроб и стеатохепатит

специфични

Характеристики на модели мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини и диета с дефицит на метионин-холин.

Възпалението е адресирано и на молекулярно ниво чрез изследване на нивото на експресия на чернодробната иРНК на гени, замесени във възпалителния процес, като напр. Tnf-α, Tlr-4, Il-1 и Tgf- β1 33. Тези гени са значително увеличени в черния дроб на мишки, хранени с MCDD (фиг. 1д).

Важно е, че поради краткия период на MCDD, нито една от тези мишки не проявява фиброза, поставяйки изследването на ранен етап по време на прогресията на NASH, избягвайки след това метаболитни последици върху хепатоцитите.

Чернодробна липидна сигнатура на неалкохолен стеатохепатит

Специфични чернодробни липиди, различаващи мишки, хранени с MCDD.

Като цяло тези резултати демонстрират, че цялостният липидомичен анализ, комбиниран с подходи за обучение на данни, е успял да характеризира специфична чернодробна липидна сигнатура на степента на мастните чернодробни заболявания, по-специално на NASH.

Серумен липиден подпис на неалкохолен стеатохепатит

Специфични серумни липиди, различаващи мишки, хранени с MCDD.

Като цяло тези резултати позволиха да се характеризира специфичен серумен липиден подпис на степента на мастните чернодробни заболявания, по-специално мишки, хранени с MCDD, които развиха NASH.

Сравнение на чернодробните и серумните подписи на неалкохолен стеатохепатит

Дискусия

Това проучване подчерта основния интерес от съчетаването на глобален подход като липидомичен с биоинформативна специфична стратегия като PAM, последвана от безпристрастен статистически подход на машината за обучение (т.е. случайни гори) 38,39,40,41. Такъв статистически работен поток позволи идентифициране на чернодробен подпис на 21 липида и серумен подпис на 14 липиди, специфични за MCDD, хранени с мишки, и беше валидиран с помощта на неконтролиран клъстер анализ.

Напоследък MCDD моделът на NASH беше най-добрият диетичен модел за бързо имитиране на човешката патология, без пряко влияние на диетата и/или генетичния фон, който може да модифицира впоследствие чернодробния и серумния липиден състав 15,28,42,43. След това подходът на статистическия работен поток успя да идентифицира чернодробни и серумни липиди, които вече бяха установени значително увеличени или намалени при пациенти или миши модели на NAHS 14,23,24,44,45,46,47,48,49,50,51, 52,53, но нито един от тези липиди не е идентифициран като биомаркер в тези проучвания досега.

Всъщност цялата липидна комбинация, съставляваща всеки подпис в черния дроб или в серума, е ключът към дискриминацията на групата NASH, вместо да се вземат предвид всеки липид.

Липиди от двата подписа, като мастни киселини, фосфолипиди, холестерол, сфингомиелини и ейкозаноиди (напр. Известно е, че 12-HETE, 18-HEPE) играят роля в структурата на мембраните или в клетъчната сигнализация 12,16,21,54. По този начин подписите могат да отразяват голямото въздействие на метаболитните заболявания на черния дроб върху клетъчните процеси. Липидите от подписите също могат да предизвикат възпаление 17,24,48,55,56,57,58,59,60,61. Интересното е, че липидните сигнатури корелират с молекулярните маркери на възпалението в нашите миши модели. Все повече доказателства предполагат, че модулацията на липидната сигнализация, използваща TLR-4 път за активиране на макрофаги, представлява (напр. освобождаване на TNF-α) общ патогенен механизъм, лежащ в основата на липотоксичността в NASH 62,63. Мастните киселини насърчават индуцирана от TNF-α индукция на хепатоцитна смърт и активиране на имунната система 64,65,66,67,68. Освобождаването на TNF-α също индуцира производството на други провъзпалителни цитокини според нашите наблюдения (напр. IL-1, TGF-β1). Хистологичните изследвания на чернодробна тъкан на мишки, хранени с MCDD само след 5 седмици, показват ранни признаци на NASH с възпаление и без фиброза, което предполага, че метаболитните нарушения и следователно получените липидни сигнатури могат да представляват ранно събитие по време на прогресията към NASH.

В заключение, ние ясно разработихме нов подход за извличане на данни, за да характеризираме специфични липидни сигнатури в ранния етап на NASH както в черния дроб, така и в серума. Този нов подход сега трябва да се прилага в клинични изпитвания при хора. Това отваря нови възможности за неинвазивна ранна диагностика на NASH и проследяване на пациенти с NAFLD.

Методи

Модели на животни

Кръвни тестове

Хранените мишки бяха обезкървени между 8 и 10 сутринта. Серумът се отделя от кръвта и се поддържа при -80 ° C до липидомичен анализ. Кръвната глюкоза се оценява от One Touch Ultra Glucometer (Lifescan Inc.) всяка сутрин между 8:00 и 9:00 ч. През 5-те седмици три пъти седмично чрез опашната вена.

Количествена RT-PCR в реално време на гени, участващи в възпалителен процес

Общата РНК се извлича от замразена тъкан на черния дроб с помощта на реагент RNA-STAT 60 (AMS Biotecnology Europe LTD, UK) и нивата се определят количествено с NanoDrop-ND1000 (Thermo Scientific). cDNAs бяха генерирани с помощта на RivertAid® First Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific, Франция) и Syber Green от FastStart Essential DNA Green Master mix (Roche, Life Science) бяха използвани за количествено определяне Tnf-α, Il1-α, Tgf-β1 и Tlr4 нива на иРНК със специфични праймери на всеки ген, описани преди 71 и обобщени в допълнителна таблица S1.

Количествената PCR в реално време се извършва с помощта на LightCycler® 96 Instrument (Roche, Life Science) машина. Нивата на генна експресия се нормализират до нивата на актин РНК и данните се анализират със софтуера LightCycler® 96 SW 1.1 (Roche, Life Science). За всяка проба генът до Гадф съотношението се изчислява въз основа на произволна стойност на копията, определена от стандартната крива за всеки ген, както е описано преди 72 .

Хистологични чернодробни оценки

Черният дроб беше отстранен и фиксиран в 4% параформалдехид в PBS (Sigma-Aldrich) за една нощ и след това вграден в парафин. Серийни участъци с дебелина 5 μm бяха изрязани върху плъзгащ се микротом (Microm HM335E, Microm Microtech) и оцветени или хематоксилин и еозин, или пикросириус в червено чрез стандартни процедури. Хистологичните чернодробни оценки са направени от експерт-патолог въз основа на дефиницията на NASH 30,31,32 и накрая слайдовете са заснети с помощта на модел на диапозитиви Scanscope 6 (Aperio CS, САЩ), изображения и анализирани от софтуер ColaPix v3.4.3 (TRIBVN, Fr) както се използва преди 72 .

Липидно профилиране

Чернодробните биопсии се хомогенизират в 2 ml метанол/EGTA (2: 1 v/v) и в 0.9 ml HBSS за анализ на ейкозаноиди с тъканен лизер FAST-PREP (MP Biochemicals) за по-нататъшни липидни анализи. Също така, еквивалентът на 0,5 mg тъкани се изпарява. Сухите пелети се разтварят в 0.25 ml NaOH (0.1 М) за една нощ и протеините се измерват с Bio-Rad анализа. Количественото определяне на липидите се изразява в nmol/mg от общите протеини.

Накратко, липидите бяха извлечени от чернодробни тъкани (еквивалентно на 1 mg емисии) или серум (10 μl) съгласно Bligh и Dyer 73 в дихлорометан/метанол/вода (2.5: 2.5: 2.1, v/v/v), в наличие на вътрешни стандарти (стигмастерол, холестерил хептадеканоат, глицерил тринонадеканоат) за количествено определяне на неутрални липиди. Дихлорометановата фаза се изпарява до сухо и остатъкът се разтваря в 20 μl етилацетат. 1 μl от липидния екстракт се анализира чрез газово-течна хроматография върху система FOCUS Thermo Electron, използвайки капилярна колона от силициев диоксид Zebron-1 Phenomenex, в съответствие с предишна публикация 74. Температурата на фурната е програмирана от 200 ° С до 350 ° С със скорост 5 ° С на минута и газът носител е водород (0,5 бара). Инжекторът и детекторът бяха съответно при 315 ° C и 345 ° C.

Фосфолипидите за относително количествено определяне се екстрахират като неутрални липиди, но с 2% оцетна киселина в присъствието на вътрешните стандарти (Cer (d18: 1/15: 0) 16 ng; PE (12: 0/12: 0) 180 ng; PC (13: 0/13: 0) 16 ng; SM (d18: 1/12: 0) 16 ng; PI (16: 0/17: 0) 30 ng; PS (12: 0/12: 0) 156.25 ng ). След центрофугиране органичната фаза се събира и суши под азот, след което се разтваря в 50 μL метанол. Пробните разтвори бяха анализирани с помощта на Agilent 1290 UPLC система, свързана с тройния квадриполен спектрометър G6460 (Agilent Technologies) и с помощта на софтуера MassHunter (Agilent Technologies) за събиране и анализ на данни. За LC сепарация се използва колона Kinetex HILIC (Phenomenex, 50 × 4, 6 mm, 2, 6 μm). Температурата на колоната се контролира при 40 ° С. Подвижната фаза А беше ацетонитрил; и В е 10 тМ амониев формиат във вода при рН 3,2. Градиентът е както следва: от 10% до 30% В за 10 минути; 10–12 минути, 100% В; и след това обратно до 10% В след 13 минути в продължение на 1 минута, за да се възстанови равновесието преди следващото инжектиране. Скоростта на потока на подвижната фаза е 0, 3 mL/min, а обемът на инжектиране е 5 μL. Източник на електроспрей беше използван в положителен (за Cer, PE, PC и SM анализ) и отрицателен йон режим (за PI и PS анализ). Сблъскващият газ е азот. Напрежението на иглата е настроено на +4000 V.

Използвани са няколко режима на сканиране. Първо, за да получим естествено различната специфична маса, анализирахме клетъчни липидни екстракти със сканиране на прекурсорни йони от 184 m/z, 241 m/z и 264 m/z до PC/SM, PI и Cer съответно; и неутрално сканиране на загуби от 141 и 87 за PE и PS съответно. Оптималите на енергията на сблъсъка за Cer, PE, PC, SM, PI, PS са съответно 2 eV, 2 eV, 30 eV, 25 eV, 45 eV и 22 eV. След това бяха използвани съответните SRM преходи, за да се определят количествено различни видове PL за всеки клас. Данните бяха обработени с помощта на QqQ Quantitative (версия B.05.00) и софтуер за качествен анализ (версия B.04.00).

За анализ на метилов естер на мастни киселини (FAME) чернодробните тъкани (еквивалент на 1 mg) или серум (10 μl) бяха извлечени като неутрални липиди в присъствието на вътрешните стандарти глицерил трихептадеканоат (2 μg) и трансметилирани 1 h в бор трифлуорид метанолов разтвор 10% при 55 ° C. След добавяне на вода (1 ml) към суровия продукт, FAME се екстрахират с хексан (3 ml), изпаряват се до сухо и се разтварят в етилацетат (20 μl). FAME (1 μl) се анализира чрез газово-течна хроматография върху система Clarus 600 Perkin Elmer, използвайки капилярни колони от силициев диоксид Famewax RESTEK (30 m × 0,32 mm i.d, дебелина на филма 0,25 μm) 75. Температурата на фурната е програмирана от 110 ° С до 220 ° С със скорост 2 ° С на минута и газът носител е водород (0,5 бара). Инжекторът и детекторът бяха съответно при 225 ° C и 245 ° C.

Ейкозаноидно профилиране

Статистически анализ

Всички изчисления се извършват с помощта на R v.3.2.2 77. За да се избегне всякакво пристрастие, дължащо се на експериментална процедура с животни, беше използван анализ за прогнозиране на микрочипове върху липиди, идентифицирани от черния дроб и серума между четирите групи мишки, определени като контролна група, хранена с нормална диета за мишки, хранени с HFD (n = 5), мишки, хранени с HFD (n = 5), контролна група, хранена с нормална диета за мишки, хранени с MCDD (n = 5) и мишки, хранени с MCDD (n = 5) и включваща анализ на хетерогенността, точен и бърз класификатор за дискриминация на мишките с болна група, хранени с MCDD спрямо останалите използвайки "памр”Пакет 78. Максималната грешка при погрешно класифициране е определена на 20% както за чернодробния, така и за серумния анализ, за ​​да се определи най-добрият праг за минимума на липидите, различаващи трите групи мишки.

Анализ на основните компоненти (PCA), 95% уверен център на елипса към средната стойност и липидите от интерес бяха изчислени и извлечени с помощта на „FactoMinR" пакет. Глобалната p-стойност беше изчислена с помощта на критичната вероятност, свързана с F-теста на дисперсионния анализ по осите на първата и втората измерения (α = 0,05).

Карта на топлината, използваща ненаблюдавана клъстеризационна дивизивна анализа (дендрограма DIANA) с евклидово разстояние, е изградена въз основа на липидите, идентифицирани в черния дроб и серума топлинна карта.2 функция в „gplots" и "клъстер”Пакети, съответно.

Променливите бяха представени като boxplot и тествани с дисперсионен анализ (ANOVA-тест, еднопосочен), последван от несдвоени т-тест. За да се тества пропорцията на различни липиди в различни групи, се използва хи-квадрат (χ 2) тест с корекция на Yate. Набор грешки тип I е 5%, двустранен.

За изчисляване на графични изображения „gplots" и "RColorBrewerСа използвани пакети.

Допълнителна информация

Как да цитирам тази статия: Chiappini, F. и др. Чернодробни и серумни липидни сигнатури, специфични за неалкохолен стеатохепатит при миши модели. Sci. Представител. 6, 31587; doi: 10.1038/srep31587 (2016).