Резюме

Наличието на антинуклеарни антитела (ANA) се свързва главно със заболявания на съединителната тъкан (CTD). Освен това тяхното присъствие се открива при здрави хора. Тези антитела са по-чести при жените и възрастните хора. Някои лекарства и ксенобиотици също са важни за развитието на автоимунитет и синтез на ANA. Освен това дефицитът на витамин D в организма на пациентите корелира с появата на тези антитела. За разлика от здравата група, положителен брой ANA се наблюдава при пациенти с атопичен дерматит (AD) и при хора с имунни нарушения. Антинуклеарни антитела с нисък брой се откриват и в хода на хронична бактериална или вирусна инфекция и при пациенти с хематологични злокачествени заболявания. Също така трябва да се има предвид възможността за фалшиво положителни резултати, които могат да бъдат причинени от избора на метод, използван за определяне на антитела. Като се вземат предвид всички тези фактори, се стига до заключението, че самият резултат на ANA няма диагностична стойност.

Епидемиология

Антинуклеарните антитела (ANA) присъстват не само при пациенти със заболявания на съединителната тъкан (CTD), но и при здрави хора. Напоследък има хипотеза, че разпространението на ANA в общата популация може да бъде свързано с имунни нарушения, характерни за даден вид. Потвърждението на това предположение е фактът, че процесът на автоимунитет протича по-често при хората, отколкото при животните [1]. Процентът на популацията с ANA е приблизително 25% чрез използване на индиректна имунофлуоресцентна микроскопия, извършена върху HEp-2 клетки (IIFA на HEp-2 или HEp-2000) [2]. Този метод е референтният метод за ANA скрининг (златен стандарт) [2, 3]. Според някои доклади, използвайки IIFA, ANA с нисък брой може да се появи при до 40% от здравите хора [4]. Освен това пациентите с CTD, като системен лупус еритематозус, склеродермия и дерматомиозит, също често са ANA положителни [3, 5, 6]. Обикновено положителните стойности на антителата могат да бъдат резултат от високата чувствителност на използваните методи, което позволява тяхното присъствие да бъде потвърдено още в случай на нисък брой и наличие на ниска луминесценция по време на имунофлуоресценция [7].

Въпреки че ANA има много висока чувствителност, неговата специфичност е доста ниска [6]. За да се избегне свръхдиагностика на автоимунни заболявания, повечето лаборатории определят горната граница като гранична точка за положителни резултати [8]. По този начин количественото определяне на антителата се извършва чрез последователни разреждания на изследвания серум, което прави възможно определянето на броя им. В клиничната практика броят означава такова разреждане на серума, когато те все още се откриват. Тъй като всички пациенти със системен лупус еритематозус (SLE) са ANA положителни, ANA тестването чрез IIFA е отличен скрининг инструмент, който е много полезен при диагностицирането на това заболяване [9]. Според Американския колеж по ревматология (ACR) и Европейската лига срещу ревматизма (EULAR) един от критериите за SLE е положителната ANA при титър 1: 80 или по-голям [10].

Честотата на значително повишено ниво на ANA в общата популация е 2,5% [2]. Повечето хора с положителен брой ANA не са диагностицирани с автоимунно заболяване и вероятността от бъдещо заболяване е ниска. Това се подкрепя от факта, че автоимунните заболявания се срещат в общата популация с честота от 5 до 7% [11] и появата на СЛЕ не надвишава 0,1% от общата популация [12]. По този начин положителната ANA не трябва да насърчава обширна диагностика на CTD при здрави индивиди без клинични признаци. Освен това, наличието на ANA в човешката популация предполага, че антинуклеарните антитела могат да бъдат важен компонент на нормалния имунен отговор. От друга страна, струва си да се помни, че наличието на антитела може да се отбележи в серума много години преди диагнозата автоимунно заболяване. Това е случаят със SLE и синдрома на Sjögren, където ANA присъстват дори много години преди появата на първите симптоми на заболяването [13, 14]. По този начин е вярно също така, че субектите, които са в предклинични стадии на SLE, са представени в ANA положителната здрава популация и измерването на тези антитела често позволява бърза диагностика на тази патология [15].

Имайки предвид, че антинуклеарните антитела могат да присъстват при здрави индивиди, както и при такива с неревматични заболявания, мониторингът на тяхното количество и по-нататъшната ревматологична диагноза трябва да се споменават само в случай на клинични симптоми. Наличието на ANA без признаци на CTD не изисква периодични ревматични прегледи. Много проучвания показват, че ANA-позитивните субекти в общата популация нямат автоимунно заболяване и е малко вероятно да развият такова в бъдеще [6, 9, 10, 15].

Методи за определяне на антинуклеарни антитела

антинуклеарни

Методи за определяне на антинуклеарни антитела.

Повишената възраст и наличието на някои CTD са силно свързани с риска от рак като цяло. Например, наличието на анти-РНК полимераза III е независим маркер за съвпадащ рак и склеродермия на всяка възраст. Такава връзка се наблюдава и при пациенти с антитела срещу топоизомераза I [26].

Ако се открие типът на флуоресцентно петно ​​или ако липсва ANA и клиничните симптоми предполагат системен CTD, трябва да се определи наличието на екстрахируеми ядрени антигенни антитела (ENA). За тази цел се използват ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA), двойна гел дифузия и имуноблот методи [16].

Имуноензимните методи, т.е. ELISA тестове, позволяват качествено и количествено определяне на антителата във всички класове имуноглобулини. Те могат да се използват за оценка на динамиката на анти-ДНК антитела в хода на терапията на SLE [3, 27]. Тестовете ELISA се характеризират с просто, но отнемащо време изпълнение. Те имат висока чувствителност и специфичност поради използването на силно пречистени антигени върху твърда среда (твърда фаза) и използването на маркирани антигени за откриване, комбинирани с вещество, чието количество или активност могат да бъдат измерени. Предимството на ELISA тестовете е елиминирането на субективния фактор по време на определянето [17, 28]. Недостатъкът на този метод е наличието на минимално замърсяване с допълнителни антигени, които причиняват фалшиво положителни резултати [17].

Както антителата, така и антигените имат способността да се дифузират в агар или агарозен гел. Методът на двойна имунодифузия позволява оценка на дифузията на изследвания серум и екстракта от тъкан, богата на ядрен материал, който е източникът на антигени в агарозния гел. Комплексът антиген-антитяло се образува в точката на среща на антигена и специфичното за него антитяло. Получените комплекси се утаяват и се виждат под формата на бели линии. Линиите на изследваните серуми се сравняват с референтните линии, съдържащи антитялото. Това е отнемащ време метод и изисква много опит в интерпретацията на резултатите, но все пак се използва поради простото му изпълнение. Характеризира се с висока специфичност поради използването на неденатурирани антигени, но чувствителността му е по-ниска в сравнение с тестовете ELISA [17, 28].

Разработването на нови диагностични технологии допринесе за въвеждането на мултиплексни методи, автоматизирани в различна степен и способни едновременно да измерват множество антинуклеарни антитела. Те често са оборудвани с експертни програми в областта на цифровия анализ на изображения. Автоматизацията на метода IIFA може значително да подобри стандартизацията на определяне на ANA и да помогне за намаляване на вътрелабораторната вариабилност [29]. От друга страна, трябва да се има предвид, че ANA са молекули с висок заряд и могат да се свързват с други заредени молекули в така наречените кръстосани реакции. Следователно, мултиплексните тестове и методът на твърдата фаза могат да дадат изкривена картина на серопозитивността спрямо използваните в момента методи. По-старите методи, т.е. методът на имунодифузия, изискват висока концентрация на антитела и следователно те не са много чувствителни [7]. На свой ред, мултиплексните тестове и тестовете в твърда фаза са чувствителни и позволяват висока производителност, но тяхното тълкуване изисква повишено внимание в случай на предклинично и субклинично заболяване, при което измерените отговори могат да бъдат ниски, поради което имунофлуоресцентните ANA тестове трябва да останат златен стандарт за ANA тестване [30, 31].

Брой женски пол и антинуклеарни антитела

Броят на антинуклеарните антитела е по-висок при жените и се увеличава с възрастта [32]. Половите хормони (особено естрогените) играят значителна роля в развитието на автоимунни заболявания и предразполагат женския пол към по-честа поява на тези заболявания [33]. Естрогените индуцират имунен отговор към Т-хелпер 2 лимфоцитите и взаимодействат чрез рецептори, открити в много клетки на имунната система. Ефектът им зависи от локалната концентрация и възпалението [34, 35]. Генетичният фактор също играе важна роля. Генните продукти, разположени върху не напълно инактивирана Х хромозома, могат да избегнат появата в тимуса и да причинят нарушение на имунната толерантност [36].

Струва си да се вземе предвид фактът, че бременността може да предизвика появата на ANA при здрави жени [16]. По време на бременността може да възникне широко излагане на ядрени антигени. Освен това се наблюдава увеличаване на възпалителната активност, която също може да повлияе на имунния отговор [37, 38].

Регулация на нивото на гена и броя на антинуклеарните антитела

Друго интересно наблюдение е определянето на връзката ANA не само с женския пол, но и с определена демографска зависимост. В проучване, проведено от Li et al. [39], най-голям брой са открити при неиспаноядките жени. В същото време беше отбелязано, че в случая на афро-американски жени и мъже броят на ANA е по-висок, отколкото при неафро-американците. Освен това присъствието на гена TGM2, който е отговорен за трансглутаминаза-2 и честотата на цьолиакия са отбелязани при здрави индивиди с висок брой ANA [39].

Важна информация беше предоставена и от проучване, определящо наличието на анти-DSF 70 антитела (плътен фин петнист антиген) [24, 40]. Антигенът DSF70 е най-разпознаваемият антиген, на който реагират антинуклеарните антитела. Те се срещат главно при хора с алергични заболявания (AD) и не са свързани с автоимунни заболявания [41, 42]. Проучване, проведено сред служители на болница за социално осигуряване Chukyo, има за цел да определи разпространението на анти-DSF70 в група здрави хора [24]. Наличието на положителна ANA е потвърдено при 20% от хората в анализираната група и анти-DSF70 антитела са открити при повече от половината от тази група (54%). Анти-DSF70 е по-често при жените (86%). Въпреки че наличието на анти-DSF70 е рядко при пациенти с автоимунни заболявания, скрининговият етап може да изключи хора, които няма да развият такива заболявания [24]. Този факт беше потвърден от проучване, проведено от бразилски изследователи. Пъстрата луминесценция, характерна за anti-DSF70, е диагностицирана само при група здрави хора, които не са развили CTD 4 години след края на проучването [18].

Наличие на ксенобиотици и антинуклеарни антитела

Има научни доклади, потвърждаващи ефекта на някои лекарства върху развитието на автоимунитет. Те включват златни соли, сулфасалазин, интравенозни имуноглобулини и TNF-α блокери (инфликсимаб), както и прокаинамид, който може да индуцира производството на ANA [16]. В допълнение към лекарствата, развитието на автоимунитет се влияе от други фактори на околната среда като тютюнев дим, силициев диоксид и различни химикали [43]. Последната група включва полихлорирани бифенили и хексахлорбензен [44, 45]. Устойчивите органични замърсители (УОЗ) също могат да причинят хормонален дисбаланс, което води до увеличаване на ANA при здрави хора и развитие на СЛЕ [46]. Доказан е и ефект на бензен, азбест и живак върху присъствието на ANA [47–49].

Серумът на група здрави доброволци е тестван като част от Националното проучване за здравни и хранителни изследвания (NHANES). Въз основа на данните, събрани през 1999–2004 г., е налице корелация между повишената концентрация на триклозан при мъжете и положителната ANA [50]. Триклозанът принадлежи към групата на фенолите и е гермицид, често използван в антибактериалните сапуни и пасти за зъби [51]. Прякият механизъм, отговорен за връзката между наличието на повишена концентрация на триклозан в урината на мъжете с наличие на повишена ANA, не е известен. Една хипотеза показва стимулирането на Т лимфоцитите като причина за автоимунни заболявания, свързани с излагане на фактори на околната среда [52]. На свой ред, изследването, проведено от Dinse et al. не потвърди предишни доклади за връзката между положителната ANA и концентрацията на живак в кръвта. Независимо от това, влиянието на живака върху развитието на автоимунитет не може да бъде изключено [50, 53].

На свой ред, изследването, проведено от Slight-Webb et al. [54] направи оценка на съвместното съществуване на ANA с провъзпалителни цитокини. В това проучване се анализира серум на здрави индивиди без наличие на ANA, при здрави индивиди с наличие на ANA и при пациенти със СЛЕ. Нивата на по-голямата част от възпалителните цитокини, т.е. интерферон-γ (IFN-γ), фактор на туморна некроза (TNF), интерлевкин-17 (IL-17) и гранулоцитен колониестимулиращ фактор (GCS), са най-високите при пациенти с SLE, по-нисък при здрави ANA-позитивни индивиди и най-нисък при тези без ANA. Доказано е, че интерфероните (INF), IL-12p40 и фактор на стволови клетки/лиганд c-Kit са повишени при пациенти със СЛЕ в сравнение със здрави индивиди с ANA. На свой ред, В лимфоцитният стимулатор (BLyS) е значително по-висок при пациенти със СЛЕ и по-нисък при здрави индивиди с положителна ANA [54].

Присъствие на витамин D и антинуклеарни антитела

Многобройни научни доклади потвърждават, че дефицитът на витамин D е свързан с някои автоимунни заболявания - включително СЛЕ [55]. В допълнение, наблюденията върху модели на мишки са доказали, че добавянето на витамин D води до намаляване на симптомите в хода на лупус [56]. Витамин D стимулира производството на В лимфоцити и имуноглобулини. Имунните клетки съдържат рецептори за витамин D и го превръщат в активната форма [57], която стимулира Toll-подобни рецептори (TLR), отговорни за повишената активност на интерферон-α (IFN-α) при пациенти със СЛЕ [58]. Имайки предвид горните данни, изследователи от Хелзинки сравняват концентрацията на витамин D при ANA-отрицателни хора, здрави хора с ANA и пациенти със СЛЕ. Връзката между активирането на лимфоцитите на витамин D и В, производството на антитела и активността на IFN-α в анализираните групи също беше оценена. Резултатите ясно показват, че дефицитът на витамин D се среща главно при здрави индивиди с положителна ANA и пациенти със СЛЕ, което може да бъде свързано с по-голяма склонност към автоимунитет [59].

Заключения

Определянето на броя и профила на антинуклеарни антитела улеснява диагностицирането на CTD. Струва си обаче да се помни, че ANA често присъстват при здрави хора, които няма да развият автоимунно заболяване. Поради този факт положителният резултат на ANA сам по себе си няма диагностична стойност. Независимо от това, подкрепено с подходяща медицинска история, това прави възможно поставянето на точна диагноза. Въпреки това, като се има предвид фактът на честото разпространение на ANA в общата популация, неговият положителен титър без клинични симптоми не трябва да бъде причина за удължаване на диагнозата CTD. Въпреки това пациентът трябва да бъде информиран, че в случай на поява на клинични симптоми трябва да се консултира с лекар. В обобщение, заслужава да се отбележи, че анализът ANA е полезен при диагностицирането на ревматични заболявания, въпреки че честото им появяване не е синоним на диагнозата CTD (Фиг. 2).