Резюме

Pneumocystis carinii пневмония (PcP) остава животозастрашаващ болестен процес, разпространен сред имуносупресираните популации. Въпреки многото подобрения в способността ни да се грижим за критично болни пациенти, смъртността, свързана с PcP, се е променила малко и остава неприемливо висока (1). Следователно са необходими нови методи за лечение, които конкретно се отнасят до патофизиологията на PcP. Смъртността е особено висока, до 80–90%, сред пациентите, които се нуждаят от прием в интензивно отделение. Последните анализи на две големи кохорти от пациенти със СПИН и PcP показаха, че необходимостта от интензивно лечение или смъртност се забелязва при или скоро след приемането (2, 3). Следователно, има идентифицируема група пациенти с PcP, които биха се възползвали от подобрен режим на лечение за PcP, ако има такъв.

намалява

Сега все повече се признава, че възпалителният отговор на гостоприемника, предизвикан от микроорганизъм, може също да причини увреждане на тъканите. Изследвания, публикувани от нас и други през последните няколко години, показаха, че това е важна характеристика на PcP (4–10). Клиничните наблюдения при хора също подкрепят връзката между възпалението и лошия резултат при пациенти с PcP (11, 12) и се предполага, че ползата от допълнителната кортикостероидна терапия е свързана с противовъзпалителните ефекти (12, 13).

Въпреки че анти-CD8 и анти-CD4 Abs за употреба при хора не са налични, пан Т-клетката Ab OKT3 (muromonab-CD3; Muromomab; Ortho Biotech, Bridgewater, NJ) понастоящем е одобрена за употреба при пациенти. Важното е, че OKT3 оказва въздействие върху CD4 + и CD8 + Т клетките. Тъй като някои пациенти с PcP могат да имат остатъчна CD4 + Т клетъчна функция, приложението на OKT3-подобен Ab би имало комбинираната полза от намеса във функцията както на CD8 +, така и на CD4 + T клетки, които могат да допринесат за патологичния възпалителен отговор. Този резултат би направил такъв подход особено полезен за лечението на PcP в условията на IRIS, при което CD4 + Т клетки са известни, че играят роля в имунопатогенезата. Крайната полза от използването на OKT3 или OKT3-подобен Ab е, че има богат клиничен опит с използването на тези молекули, което би улеснило използването им като допълнителна терапия за PcP, ако такъв подход бъде валидиран. Поради това предприехме поредица от експерименти, за да предоставим експериментални данни за животни за ефекта на анти-CD3 Ab върху резултата от PcP. Използвахме модел на имунно възстановяване, който имитира PcP-индуциран IRIS. Нашите открития предполагат, че този подход може да има клинична употреба при лечението на умерен до тежък PcP.

Материали и методи

Приготвяне на F (ab ′) 2 фрагмента

Хибридомна клетъчна линия 145 2C11, която произвежда хамстер против мишка CD3 Ab, е получена от Американската колекция от типови култури (18). Ab се пречиства чрез утаяване с наситен амониев сулфат и пречистване на протеин А на асцитна течност, получена от SCID мишки. F (ab ′) 2 фрагменти се приготвят от непокътнат Ab по предварително публикуван протокол (19) със следните модификации: Ab се усвоява с пепсин при 37 ° C в продължение на четири часа. Fc фрагментите се отстраняват чрез преминаване на Ab върху протеинова колона А, която позволява на F (ab ') 2 да премине. Цял хамстер IgG се използва за получаване на контрол F (ab ') 2, използвайки същия метод. За тези експерименти са използвани F (ab ′) 2 фрагменти, за да се избегнат потенциално объркващите ефекти на генерализираното освобождаване на цитокини, понякога наблюдавани, когато CD3 е омрежен от непокътнат Ig.

Подготовка на миши организми Pneumocystis

CB.17 scid/scid мишки с тежки инфекции с P. carinii бяха евтаназирани и белите им дробове бяха отстранени асептично. P. carinii организми са изолирани от белодробната тъкан, както е описано по-рано (10, 20). Крайният препарат се оцветява с амонячно сребро за изброяване на кисти и Diff-Quick (Dade AG, Dudingen, Швейцария) за скрининг за бактериално замърсяване. Освен това препаратите рутинно се поставят върху предлаганите в търговската мрежа плочи с шоколадов кръвен агар, за да се тества за наличие на замърсяващи микроорганизми.

Обработка на мишки с F (ab ′) 2 фрагменти в миши модел на свързана с PcP IRIS

Мишките бяха заразени чрез интраназално инокулиране с 1 × 105 5 кисти на P. carinii. Четири седмици по-късно заразените SCID мишки бяха възстановени имунно с 5 × 107 спленоцити от сингенни донорски щамове, за да имитират IRIS, както е описано по-рано (4, 8). Лечението с анти-CD3 F (ab ′) 2 е започнало, когато мишките са имали явна симптоматика, което ние определяме или като средна загуба на телесно тегло> 10%, или като средна честота на дишане> 400 дишания в минута. По този начин експерименталните мишки бяха наблюдавани с определяне на телесното тегло и честотата на дишане и лечението с F (ab ′) 2 беше започнато ∼1 седмица след възстановяване на имунитета (дни 7-9). На експериментални мишки бяха дадени или 150 μg 145 2C11 F (ab ′) 2 или контролен F (ab ′) 2 ip през ден.При един експеримент, група мишки са получили anti-CD3 F (ab ′) 2 само на трети и трети ден в допълнение към триметоприм-сулфаметоксазола (TMP Лечение -SMX). TMP-SMX (Sicor Pharmaceuticals, Irvine, CA) започва лечение 1 ден след анти-CD3 лечение като единична дневна доза до края на експеримента. TMP-SMX се разрежда във физиологичен разтвор и се дава на 20 mg TMP на килограм телесно тегло, както е описано (21).

Физиологична оценка на динамичното белодробно съответствие и устойчивост при мишки

Бронхоалвеоларен лаваж и подготовка на белодробната тъкан

Бронхоалвеоларен лаваж (BAL) и проби от белодробна тъкан са получени след динамично измерване на съответствие. Гръдната кухина беше хирургически отворена, за да се разкрият белите дробове и трахеята, а левият белодробен лоб беше здраво завързан в бронха с хирургическа коприна и отстранен със стерилни ножици. Останалите белодробни лобове се промиват внимателно с четири, 1 ml аликвоти от 1 × HBSS през трахеалната канюла. Възстановената промивна течност (~ 3,5 ml на мишка) се центрофугира при 250 х g за 5 минути, за да се получи клетъчната фракция. Клетките бяха ресуспендирани в пресен HBSS, изброени, центрофугирани върху стъклени стъкла и оцветени с Diff-Quick за диференциално броене. В допълнение е извършен многопарамерен поточен цитометричен анализ на BAL клетки след оцветяване с конюгиран с флуорохром Ab. Анти-CD4-флуоресцеин (клон RM4-4) и анти-CD8a-перидинин хлорофил-протеин (клон 53-6.7) са закупени от BD Biosciences (Сан Диего, Калифорния). Най-малко 5000 събития на BAL проба са рутинно анализирани на FACSCalibur клетъчен сортиращ (BD Biosciences).

Измерване на тежестта на пневмоциста чрез количествена PCR в реално време

статистически анализи

Всички отчетени стойности за всяка експериментална група са средно ± 1 SE измерване. Анализът беше извършен с помощта на Sigma-Stat версия 3.5 (Systat Software, Point Richmond, CA). Различните групи бяха сравнени чрез извършване на еднопосочна ANOVA. В случаите, в които ANOVA е значима, отделни групи са тествани с двойно t тест. Анализът на оцеляването е направен с помощта на теста на Kaplan-Maier Log-rank. В допълнение, отделни групи бяха сравнени по двойки, използвайки точния хи-квадрат тест на Fisher. Тестът се счита за важен при p Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Ефект на анти-CD3 лечение върху белодробната функция по време на PcP-асоцииран IRIS при мишки. Беше проведено тестване на белодробната функция на мишките или на 6-ия ден (в експеримент два) или на 8 (в експеримент един) след започване на лечението с анти-CD3. Резултатите са обединени данни от два независими експеримента и всяка точка от данните е средната аритметична стойност ± 1 SEM (n = 7-11 мишки за всички групи). A, Динамични измервания за съответствие на белите дробове (* p = 0,004). B, Измервания на съпротивлението на дихателните пътища (** p = 0,002).

Лечението срещу CD3 намалява свързаните с PcP белодробни Т-клетъчни реакции

Подобрената белодробна функция при мишки, получаващи анти-CD3 F (ab ′) 2, е свързана с намален брой възпалителни клетки в белия дроб (Таблица II). Както би могло да се очаква, анти-CD3 F (ab ') 2 предизвиква значително намаляване както на CD8 +, така и на CD4 + Т лимфоцитите. В допълнение, както макрофагите, така и неутрофилите също бяха намалени, което показва цялостно намаляване на патологичния възпалителен отговор.

Лечението с анти-CD3 пречи на медиирания от гостоприемника клирънс на P. carinii при имунно възстановени SCID мишки

Ограниченото лечение след CD анти-CD3 подобрява преживяемостта на мишки с IRIS, свързан с PcP

Промени в телесното тегло на експериментални мишки. Процентната загуба на телесно тегло (в сравнение с върховото тегло) за различни групи експериментални мишки се начертава спрямо дните след разтварянето. Всяка точка от данни представлява средната аритметична стойност ± SEM. Вертикалните стрелки означават смърт в тази група през този ден. Числата в скоби представляват броя на оцелелите мишки на общ брой мишки в тази експериментална група. ●, контролирайте IgG F (ab ′) 2; ○, контролен IgG F (ab ') 2 + TMP-SMX; ▼, анти-CD3 F (ab ′) 2 (третирани по време на експеримента) + TMP-SMX; △, анти-CD3 F (ab ′) 2 (третиран само два пъти) + TMP-SMX.

Дискусия

PcP е инфекциозно заболяване със значителна заболеваемост и смъртност, което се дължи на възпалителния отговор на гостоприемника, както е показано както при пациенти (11, 12), така и при животински модели (4, 5, 8). Доказано е, че присъствието на Т-клетки е необходимо за иницииране на възпалителния имунен отговор към P. carinii, което от своя страна води до така нареченото странично увреждане на белия дроб. В повечето клинични сценарии на пациентите липсват CD4 + Т клетки, като по този начин оставя предимно CD8 + Т клетъчен отговор, който е неефективен при убиването на P. carinii, но води до критично нараняване на белите дробове (4, 5, 8). В други клинични ситуации, като IRIS, CD4 + Т клетки също участват във възпалителния отговор. За разлика от CD8 + Т клетките, задвижваният от CD4 + T клетки имунен отговор допринася за ликвидирането на P. carinii, въпреки че тези отговори могат да доведат до още по-голямо увреждане на белите дробове (4).

По-рано показахме, че възпалителното увреждане, свързано с PcP-свързана IRIS, може значително да бъде предотвратено чрез изчерпване на CD4 + и CD8 + Т-клетките преди имунното възстановяване (4, 8). Въпреки че това е лесно постижимо при модели на мишки, понастоящем не са налични терапевтични средства за постигане на това при хора. Пан Т клетъчен Ab, OKT3 (Muromonab), се предлага за клинична употреба като имуносупресивно средство, особено при контрола на отхвърлянето на трансплантанта. OKT3 и подобни Abs работят, като причиняват частично изчерпване на Т-клетките и по-важното чрез нарушаване на взаимодействието на CD3 с Т-клетъчния рецептор, необходим за разпознаването и активирането на Ag-клетките на Т-клетките (25). Тъй като CD4 + и CD8 + Т клетки експресират CD3, ние разсъждавахме, че използването на Ab, насочено срещу CD3, би довело до инактивиране на Т клетки, подобно на това, наблюдавано при специфични моноклонални Abs при мишки.

SCID мишки с PcP, които бяха възстановени имунно и третирани с анти-CD3 F (ab ') 2 фрагменти, показаха подчертана физиологична полза. Тези подобрения са статистически значими и клинично значими. Лекуваните мишки демонстрират намалено белодробно възпаление, подобрено динамично съответствие, подобрена белодробна устойчивост и подобрена преживяемост. Увеличеният брой на неутрофилите в белодробната промивна течност е корелиран с повишена тежест на PcP при пациенти и модели на мишки (12, 26). Използването на анти-CD3 F (ab ′) 2 в нашия модел доведе до значително намаляване на броя на неутрофилите в промивната течност, което беше свързано с по-малко тежко заболяване. Интересното е, че броят на макрофагите също е намален, въпреки че значението на това наблюдение по отношение на нараняването, причинено от възпалителния отговор, предизвикан от P. carinii, е неизвестно.

Подходът, очертан в тези експерименти за по-нататъшно имуносупресиране на имуносупресиран пациент, може да се тълкува като контрапродуктивен. Важно е обаче да се отбележи, че потискането на белодробната възпалителна реакция ще се извършва заедно с приложението на антибиотици. Важно е, че TMP-SMX намалява тежестта на P. carinii, когато се дава с анти-CD3 F (ab ′) 2 фрагменти. За тези експерименти се дава анти-CD3 F (ab ') 2 през ден до прекратяването на експериментите. Този график е избран, тъй като OKT3 обикновено се прилага ежедневно в продължение на 5–10 дни, когато се използва за лечение на отхвърляне на трансплантация. Биологичните ефекти на OKT3 обаче са очевидни в рамките на минути след инфузията (25). Това бързо начало на действие може да е причината анти-CD3 лечението да е ефективно при вече симптоматични мишки. Освен това, както демонстрира експериментът, описан на фиг. 4, може да е възможно да се използват по-малко дози анти-CD3 за потискане на възпалението, докато TMP-SMX влиза в сила. Краткосрочната употреба на OKT3 би намалила страничните му ефекти и би съкратила периода на индуцирана от лекарството имуносупресия.

Въпреки че избрахме да използваме подобен на OKT3 Ab, нашите резултати предполагат, че други терапии, които нарушават функцията на Т-клетките, могат да бъдат ефективна допълнителна терапия за PcP. Например, моноклонален Ab към рецептора IL-2α (CD25; Basiliximab; Novartis Pharmaceuticals, Базел, Швейцария) също може да бъде ефективен в тази обстановка. В допълнение към глобалното потискане на Т-клетъчната функция, може да е възможно да се идентифицират и инхибират специфични молекулярни пътища, които водят до увреждане на белите дробове по време на PcP.

В обобщение, патогенезата на PcP включва имунно-медииран възпалителен отговор, който причинява нарушена белодробна функция. Т-клетките, особено CD8 + Т-клетките, са критичен компонент на този възпалителен отговор. Ние показахме, че инактивирането на Т клетки с Ab, насочено срещу молекулата CD3, води до значителна физиологична полза за мишки със симптоматичен PcP. В краткосрочен план това подобрение се наблюдава и при мишки, които не се лекуват с антибиотици, за да убият P. carinii, подкрепяйки заключението, че увреждането на белите дробове по време на PcP е имунно медиирано явление. Клиничната полза от използването на анти-CD3 като допълнителна терапия при пациенти с PcP ще изисква клинични проучвания. Нашите резултати подкрепят такъв подход.

Благодарности

Благодарим на Маргарет Chovaniec, Nabilah Khan и Jane Malone за техническата подкрепа. Благодарим на д-р Jing Wang за критичното четене на ръкописа.

Разкриване Авторите нямат финансов конфликт на интереси.

Бележки под линия

Тази работа беше подкрепена от Национален здравен институт Grant 1R01HL092797.

Съкращения, използвани в тази статия: BAL бронхоалвеоларен лаваж IRIS имунна реституция възпалителен синдром PcP Pneumocystis carinii пневмония TMP-SMX триметоприм-сулфаметоксазол.