Допринесе еднакво за тази работа със: Zhi Xu, Xinying Huo

анализ

Отделение по онкология, Асоциирана първа болница в Нанкин, Медицински университет в Нанкин, Нанкин, Китай

Допринесе еднакво за тази работа със: Zhi Xu, Xinying Huo

Специализиран отдел по онкология, Свързана първа болница в Нанкин, Медицински университет в Нанкин, Нанкин, Китай

Принадлежност San Valley Biotechnology Incorporated, Пекин, Китай

Принадлежност San Valley Biotechnology Incorporated, Пекин, Китай

Affiliation Norris Comprehensive Cancer Center, Катедра по молекулярна микробиология и имунология, Медицински факултет на Кек, Университет на Южна Калифорния, Лос Анджелис, Калифорния, Съединени американски щати

Принадлежност San Valley Biotechnology Incorporated, Пекин, Китай

Принадлежност San Valley Biotechnology Incorporated, Пекин, Китай

Принадлежност San Valley Biotechnology Incorporated, Пекин, Китай

Принадлежност San Valley Biotechnology Incorporated, Пекин, Китай

Принадлежност San Valley Biotechnology Incorporated, Пекин, Китай

Принадлежност San Valley Biotechnology Incorporated, Пекин, Китай

Принадлежност San Valley Biotechnology Incorporated, Пекин, Китай

Принадлежност San Valley Biotechnology Incorporated, Пекин, Китай

Принадлежност San Valley Biotechnology Incorporated, Пекин, Китай

Принадлежност San Valley Biotechnology Incorporated, Пекин, Китай

Принадлежност San Valley Biotechnology Incorporated, Пекин, Китай

Принадлежност San Valley Biotechnology Incorporated, Пекин, Китай

Принадлежност San Valley Biotechnology Incorporated, Пекин, Китай

Принадлежност San Valley Biotechnology Incorporated, Пекин, Китай

Отделение по онкология, Асоциирана първа болница в Нанкин, Медицински университет в Нанкин, Нанкин, Китай

Отделение по онкология, Асоциирана първа болница в Нанкин, Медицински университет в Нанкин, Нанкин, Китай

Специализиран отдел по онкология, Свързана първа болница в Нанкин, Медицински университет в Нанкин, Нанкин, Китай

Отделение по онкология, Асоциирана първа болница в Нанкин, Медицински университет в Нанкин, Нанкин, Китай

Отделение по онкология, Асоциирана първа болница в Нанкин, Медицински университет в Нанкин, Нанкин, Китай

Специализиран отдел по онкология, Свързана първа болница в Нанкин, Медицински университет в Нанкин, Нанкин, Китай

Отделение по онкология, Асоциирана първа болница в Нанкин, Медицински университет в Нанкин, Нанкин, Китай

Отделение по онкология, Асоциирана първа болница в Нанкин, Медицински университет в Нанкин, Нанкин, Китай

Отделение по онкология, Асоциирана първа болница в Нанкин, Медицински университет в Нанкин, Нанкин, Китай

Affiliation Norris Comprehensive Cancer Center, Катедра по молекулярна микробиология и имунология, Медицински факултет на Кек, Университет на Южна Калифорния, Лос Анджелис, Калифорния, Съединени американски щати

Affiliation Norris Comprehensive Cancer Center, Катедра по молекулярна микробиология и имунология, Медицински факултет на Кек, Университет на Южна Калифорния, Лос Анджелис, Калифорния, Съединени американски щати

Affiliation Norris Comprehensive Cancer Center, Катедра по молекулярна микробиология и имунология, Медицински факултет на Кек, Университет на Южна Калифорния, Лос Анджелис, Калифорния, Съединени американски щати

Отделение по онкология, Асоциирана първа болница в Нанкин, Медицински университет в Нанкин, Нанкин, Китай

  • Джи Сю,
  • Синин Хуо,
  • Хуа Йе,
  • Chuanning Tang,
  • Виджаялакшми Нандакумар,
  • Фън Лу,
  • Дандан Джанг,
  • Хайчао Донг,
  • Хонг Слънце,
  • Шоуен Дзян

Фигури

Резюме

Цитат: Xu Z, Huo X, Ye H, Tang C, Nandakumar V, Lou F, et al. (2014) Анализ на генетичната мутация на човешки стомашни аденокарциноми с помощта на платформа за секвениране на потоци от йони. PLoS ONE 9 (7): e100442. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0100442

Редактор: Masaru Katoh, Национален център за борба с рака, Япония

Получено: 20 февруари 2013 г .; Прието: 28 май 2014 г .; Публикувано: 15 юли 2014 г.

Финансиране: Работата е подкрепена с безвъзмездни средства от Националната фондация за естествени науки на Китай на д-р Jinfei Chen (грант № 81272469) и д-р Zhi Xu (грант № 81000880); безвъзмездна помощ от 12-тата петгодишна програма за развитие на здравето чрез технологии и образование на провинция Дзянсу за д-р Джинфей Чен; и безвъзмездните средства от фондация Wu Jieping и Националните здравни институти (R01 CA90427 и R01 AI084811 за Si-Yi Chen). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Автори Hua Ye, Chuanning Tang, Feng Lou, Dandan Zhang, Haichao Dong, Hong Sun, Shouwen Jiang, Guangchun Zhang, Zhiyuan Liu, Zhishou Dong, Baishuai Guo, He Yan, Chaowei Yan, Lu Wang, Ziyi Su и Yangyang Li са служители на San Valley Biotechnology, Inc. Това не променя придържането на авторите към всички политики PLOS ONE за споделяне на данни и материали.

Въведение

Ракът на стомаха е вторият най-често срещан рак в света с честота, която варира значително в различните географски местоположения. Честотата му е най-висока в Япония, Източна Азия, Южна Америка и Източна Европа, докато Канада, Северна Европа, Африка и САЩ имат най-ниска честота [1]. Въпреки това, той остава третият най-често срещан стомашно-чревен злокачествен тумор в Северна Америка след колоректален рак и рак на панкреаса и често се среща след 40-годишна възраст [2]. Класификацията на Lauren разделя стомашния рак на два основни хистологични типа: чревен или дифузен. Дифузният тип рак има некохезивни туморни клетки, дифузно проникващи в стромата на стомаха и често показват дълбока инфилтрация в стомашната стена с малко или никакво образуване на жлеза. Чревният тип рак, от друга страна, показва разпознаваемо образуване на жлеза, подобно по микроскопски вид на лигавицата на дебелото черво [3]. Повечето видове рак на стомаха са спорадични, но 8–10% са генетично наследени [2].

Доказано е, че много често активирани онкогени съдържат мутации при рак на стомаха. Единичните или комбинаторни терапевтични средства, насочени към генетични мутации, се превръщат в привлекателни възможности за лечение на рак на стомаха. Например, трастузумаб е одобрен в комбинация с химиотерапия за лечение на ERBB2-позитивен рак на стомаха [4]. EGFR, друга рецепторна тирозин киназа, се забелязва поради свръхекспресията си при някои видове рак на стомаха и в момента се провеждат опити, използващи използването на EGFR инхибитори [5]. По същия начин ракът на стомаха е свързан с свръхекспресията или амплификацията на други молекули като MET, MSTIR и FGFR2, а множество следи, тестващи ефикасността на инхибиторите срещу тези молекулярни мутации, също продължават [6], [7].

Материали и методи

Декларация за етика

Изследването е одобрено от Етичния комитет на свързаната първа болница в Нанкин, Медицински университет в Нанкин, Китай. За фиксирани с формалин и вградени в парафин (FFPE) туморни проби няма информирано съгласие, поради което всички проби и медицински данни, използвани в това проучване, са необратимо анонимизирани.

Информация за пациента

Туморни проби, използвани в проучването, са събрани от свързаната първа болница в Нанкин, Медицински университет в Нанкин, Китай. Бяха анализирани общо 238 проби от тумор на FFPE от пациенти със стомашен аденокарцином. Средната възраст на 238 пациенти е 60 години (диапазон, 28–81). От 238 проби 135 тумора са дифузни и 103 тумора са чревни.

ДНК подготовка

ДНК е изолирана от проби от FFPE след депарафинизация и екстракция на парафинови секции с дебелина 3–5 µm в ксилол и с помощта на QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) съгласно инструкциите на производителя.

Подготовка и секвениране на библиотека на Ion Torrent PGM

Направена е библиотека, свързана с Ion Torrent адаптер, съгласно протокола Ion AmpliSeq Library Kit на производителя 2.0 (Life Technologies, Част # 4475345 Rev. A). Накратко, 50 ng обединени ампликони бяха поправени в крайна сметка и Ion Torrent адаптери P1 и A бяха лигирани с помощта на ДНК лигаза. След пречистване на зърна AMPure (Beckman Coulter, Brea, CA, USA), продуктите, свързани с адаптер, бяха преведени с ник и PCR-амплифицирани за общо 10 цикъла. Получената библиотека беше пречистена с помощта на AMPure мъниста (Beckman Coulter) и концентрацията и размерът на библиотеката бяха определени с помощта на Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) и Agilent BioAnalyzer DNA High-Sensitivity LabChip (Agilent Technologies).

Примерна емулсия PCR, разрушаване на емулсията и обогатяване са извършени с помощта на Ion Xpress Template Kit (Част # 4467389 Rev. B), в съответствие с инструкциите на производителя. Накратко, входна концентрация на едно копие на ДНК шаблон/Ion Sphere Particles (ISPs) беше добавена към основния микс на емулсията PCR и емулсията беше генерирана с помощта на IKADT-20 миксер (Life Technologies). След това доставчиците на интернет услуги бяха възстановени и положителните за шаблон доставчици бяха обогатени за използване на мъниста Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (Life Technologies). Обогатяването на ISP беше потвърдено с помощта на флуорометъра Qubit 2.0 (Life Technologies). Последователността беше извършена с помощта на 316 чипа на Ion Torrent PGM за 65 цикъла и за тези проби беше използван баркод. Комплектът за секвениране на йони v2.0 е използван за реакции на секвениране, следвайки препоръчания протокол (Част номер 4469714 Rev. B).

Вариантно обаждане

Данните от PGM изпълненията бяха обработени първоначално с помощта на специфичния за платформата Ion Torrent софтуер Torrent Suite за генериране на четения на последователности, изрязване на последователностите на адаптера, филтриране и премахване на лошите четения в профила на сигнала. Първоначалното извикване на вариант от данните за последователността на Ion AmpliSeq е генерирано с помощта на Torrent Suite Software v3.0 с приставка „вариант на обаждащия се v3.0“ програма. За да се елиминира грешното базово извикване, бяха използвани няколко стъпки за филтриране за генериране на окончателно извикване на вариант (Фиг. S1). Първият филтър беше настроен на средна дълбочина на общото покритие> 100, покритие на всеки вариант> 20, честота на вариант на всяка проба> 5% и P-стойност Фигура 1. Разпределение на четене на последователност между 189 ампликони, генерирани от 238 Образци на FFPE, нормализирани до 300 000 четения на проба.

А. Разпределение на средното покритие на всеки ампликон. Данните са показани като средно ± SD. Б. Брой ампликони с дадена дълбочина на четене, сортирани в контейнери от 100 четения. Сините ленти представляват броя на целевите ампликони в дълбочината на четене, червената линия представлява% от целевите ампликони ≥ дълбочина на четене.

В това проучване ние секвенирахме 238 проби от човешки стомашен аденокарцином със средна дълбочина на покритие на целевите локуси> 100 (Фигура 1А). Туморите в нашия набор от проби бяха класифицирани в дифузен или чревен тип въз основа на класификацията на Lauren (маса 1). Използвайки строг стандартен вариант на обаждане, идентифицирахме мутации в следните гени (Таблица 2): APC, BRAF, ERBB2 FBXW7, KIT, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RB1, SMAD4 и висока поява на мутация по гена TP53. Подробни честоти на миссенс, точкови мутации, вмъквания и делеции, профилирани върху 737 локуса на 45 туморни супресорни гени и онкогени на 238 проби от стомашен аденокарцином са предоставени в Таблица S1. Нашият набор от проби включва тумори, отбелязани на различни етапи на заболяването (Ia, Ib, II, IIIa, IIIb, IV) въз основа на системата за стадиране на рак AJCC/TNM (Таблица 3), и също бяха с различен потенциал за диференциация (Таблица 4). Подробен анализ на секвенцията в екзоните и функционалните домейни на TP53 е посочен по-долу.

Разпространение на мисенс мутация в екзоните и функционалните домейни на TP53

А. Честоти на откритите мутации в различни екзони. Б. Разпределение на мутациите в екзони. В. Разпределение на мутациите във функционални домейни.

Множество мутации и мутационни горещи точки при стомашни аденокарциноми

Клиничният успех с индивидуализирана комбинирана терапия разчита на идентифицирането на мутационни комбинации и модели за едновременно приложение на единично или комбинация от целеви агенти срещу откритите мутационни комбинации. Някои от мутациите, открити в нашата туморна група чрез секвениращ анализ, са не само повтарящи се и чести, но също така се появяват в комбинация с други мутации. 13,6% от пробите са имали поне една или повече миссенс мутации, 1,70% са имали поне две или повече миссенс мутации, 0,4% са имали поне три или повече миссенс мутации и 86,1% от пробите не са имали вредни мутации в нито един от скринираните 737 локуса на потенциалните туморни супресорни гени и онкогени (Таблица 5).

Дискусия

Стомашният аденокарцином, най-често срещаният вид рак на стомаха, е хетерогенен и честотата и причината варират в широки граници в зависимост от географските региони, пола, етническата принадлежност и диетата [20]. Инфекциозният агент Helicobacter pylori е свързан с хроничен атрофичен гастрит, възпалителен предшественик на стомашния аденокарцином [20]. Докато H. pylori колонизира стомашния тракт на по-голямата част от населението на света и предизвиква мутации и геномна нестабилност в ДНК на гостоприемника, само индивиди със сложен рисков профил са склонни да развият рак [21].

подкрепяща информация

Фигура S1.

Процес на филтриране на варианти. (а) Вариантите, пристрастени към нишките, бяха елиминирани с помощта на софтуера Integrative Genomics Viewer (IGV) (http // www.broadinstitute.org/igv); (б) Вариантите в AMPL339432 трябва да бъдат елиминирани, тъй като този ампликон не е уникален, съчетан с PIK3CA в човешкия геном; (в) Целият ни статистически анализ се основава на данните в синьо поле.

Таблица S1.

Честота на точкови мутации, вмъкване и делеция на мутации в 737 локуса на 45 гена в 238 GA.