Резюме

Предназначение: Рецепторите на епидермален растежен фактор (EGFR) са необходими за насърчаване на тумора чрез западна диета. Металопротеазата ADAM17 активира EGFR чрез освобождаване на про-EGFR лиганди. ADAM17 се регулира от рецептори, свързани с G-протеин, включително CXCR4. Тук изследвахме CXCR4 – ADAM17 кръстосани взаимодействия и изследвахме ролята на ADAM17 в туморогенезата.

дейност

Експериментален дизайн: Използвахме CXCR4 инхибитор, AMD3100 и ADAM17 инхибитор, BMS566394, за да оценим CXCR4 – ADAM17 кръстосани препратки в раковите клетки на дебелото черво. Сравнихме експресията на CXCR4 лиганд, CXCL2 и ADAM17 при мишки, хранени със западна диета, спрямо стандартната диета. Отделно мишките бяха третирани с маримастат, широкоспектърен ADAM17 инхибитор или AMD3100, за да се оцени EGFR активирането от ADAM17 и CXCR4. Използвайки мишки Apc-мутант Min, ние изследвахме ефектите на ADAM17/10 инхибитора INCB3619 върху туморогенезата. За да се оценят ефектите от колоноцит ADAM17, мишки с условно делеция на ADAM17 бяха третирани с азоксиметан (AOM). Експресията на ADAM17 също се сравнява в колоноцити от първичен човешки рак на дебелото черво и съседна лигавица.

Резултати: Лечението с CXCL12 активира EGFR сигнали на ракови клетки на дебелото черво и блокадата CXCR4 или ADAM17 намалява това активиране. In vivo, западната диета повишава CXCL12 в стромалните клетки и TGFα в колоноцитите. Marimastat или AMD3100 причиняват> 50% намаляване на EGFR сигналите (P 2,5 пъти в човешки злокачествени колоноцити.

Транслационна релевантност

Западните диети са замесени в спорадичен рак на дебелото черво. Рецепторите за епидермален растежен фактор (EGFR) са повишени при човешки рак на дебелото черво и са необходими за промоция на тумора чрез западна диета при модели на рак на дебелото черво. EGFR се активира от рецепторни лиганди, освободени от мембранно свързани лиганди. ADAM17 и ADAM10 са основни ензими, които регулират освобождаването на EGFR лиганд. Докато ADAM17 е повишен при спорадичен рак на дебелото черво, няма проучвания директно да проверят дали този ензим насърчава развитието на тумори. Освен това, тъй като ADAM17 контролира освобождаването на много субстрати, неговата роля в развитието на рак на дебелото черво не е предсказуема. В това проучване, използвайки както генетични, така и химични модели на рак на дебелото черво, ние за първи път демонстрираме, че ADAM17, а вероятно и ADAM10, насърчават тумора. Това установява ADAM17 като потенциална терапевтична цел за профилактика на рак на дебелото черво. Освен това разкрихме потенциално важен път, свързващ ADAM17 със запазения с диета рак на дебелото черво, включващ CXCL12 – CXCR4 като сигнали нагоре по веригата, активиращи ADAM17.

Въведение

Ракът на дебелото черво е основна причина за свързаната с рака заболеваемост и смъртност в Западния свят (1). Повечето видове рак на дебелото черво са спорадични и западните диети са замесени в тяхната патогенеза (2). Западните диети са бедни на смилаеми фибри и богати на животински мазнини. Нарастващите епидемии от затлъстяване и захарен диабет в Съединените щати са свързани със западната диета и също са свързани с повишен риск от рак на дебелото черво (3, 4). Тревожното е, че честотата на рака на дебелото черво в световен мащаб се увеличава, тъй като все повече страни приемат западни диети (1, 5). По този начин усилията за повишаване на нашето разбиране за механизмите, чрез които западните диети насърчават рака на дебелото черво са важни за разработването на по-ефективни стратегии за предотвратяване на това заболяване.

Експериментални модели на рак на дебелото черво се използват широко за дисекция на влиянията, свързани с диетата при туморогенезата на дебелото черво. Както генетичният Apc-мутант Min мишка, така и индуцираният от канцероген азоксиметан (AOM) модел на рак на дебелото черво се използват широко за изследване на ролята на хранителните фактори в развитието на тумора (6, 7). Западната диета насърчава туморогенезата в модела AOM и Min на мишки (8–10). В предишни проучвания, използвайки EGFR инхибитори, ние показахме, че сигналите от тези рецептори са необходими за ефективно индуцирано от AOM развитие на тумор при гризачи (11, 12). Също така установихме, че този рецептор е необходим за индуцирана от Западната диета промоция на тумори в моделите AOM и азоксиметан/декстран сулфат натрий (AOM/DSS) (9, 10).

EGFR е член на семейството на трансмембранните ErbB тирозин киназни рецептори, които контролират растежа и диференциацията на епител на дебелото черво (13). EGFR се експресира върху епителни клетки на дебелото черво и стромални клетки, включително фибробласти и ендотелни клетки (14, 15). Този рецептор се активира от множество лиганди, включително TGFα и амфирегулин (AREG), които се произвеждат в дебелото черво от епителни клетки и стромални клетки. При свързване на лиганда, EGFR хомодимеризира или хетеродимеризира с други членове на ErbB. Димеризацията стимулира активността на вътрешния рецептор тирозин киназа (13). При рак на дебелото черво EGFR се активира най-често чрез увеличаване на изобилието на лиганди (16). В тази връзка показахме, че западната диета сама увеличава TGFα на лигавицата на дебелото черво, докато TGFα и амфирегулин са увеличени при тумори на дебелото черво (9).

ADAM ензимите (членове на семейството на дезинтегрин и металопротеиназа) регулират разцепването на EGFR лиганди от мембранно свързани лиганди. Освобождаването на TGFα и AREG се контролира от ADAM17, за който е доказано, че е увеличен при човешки рак на дебелото черво (17). Тъй като западната диета увеличава TGFα, беше от интерес да се изследват ефектите от западната диета върху експресията на ADAM17. При много видове рак ADAM17 е и точка на сближаване надолу по веригата на G-протеин-свързани рецептори (GPCR; справка 18), която може да увеличи активността на ADAM17. В това отношение GPCR CXCR4 и неговият лиганд CXCL12 са замесени в прогресията на рака на дебелото черво (19). Използвайки фармакологични инхибитори, попитахме дали западната диета може да промени CXCL12 in vivo и дали сигналите CXCL12 – CXCR4 могат да регулират ADAM17 – EGFR сигналите в клетките на рака на дебелото черво in vitro. Маримастат е широкоспектърен инхибитор на металопротеазата, който блокира активността на ADAM17, а AMD3100 е мощен инхибитор на CXCR4 (20, 21). Тук, използвайки маримастат и AMD3100, ние изследвахме изискванията за активност ADAM17 и сигнали CXCL12 – CXCR4 в промотираните от Западна диета сигнали на EGFR на дебелото черво.

Във фибробластите ADAM17 и ADAM10 регулират освобождаването на различни EGFR лиганди (22). Наличието на двоен инхибитор ADAM17 и ADAM10 INCB3619 ни позволи да изследваме ролята на тези ензими в чревната туморогенеза в мишката Min (23). Този модел изисква EGFR сигнали за силна туморогенеза и отговаря на западната диета с повишено туморно бреме (8, 24, 25). За да изолираме ефектите на ADAM17 и да дисектираме специфичната за клетките роля на ADAM17 в развитието на рак на дебелото черво, ние изследвахме ефекта от изтриването на ADAM17 от епителните клетки на дебелото черво в модела AOM. По този начин в настоящото проучване изследвахме ролята на ADAM17 в два различни модела на рак на дебелото черво, насърчавани от диетата. Използвайки специфичен за ADAM17 инхибитор BMS566394, ние също установихме, че сигналите CXCL12 – CXCR4 активират EGFR чрез ADAM17 в раковите клетки на дебелото черво. Взети заедно, резултатите от това проучване разширяват нашето разбиране за веригата CXCL12 – CXCR4, активираща ADAM17 като потенциална връзка между EGFR и западната диета при рак на дебелото черво.

Материали и методи

За подробности вижте Допълнителни материали и методи.

Експериментални животни

Архивирана лигавична тъкан на дебелото черво за проучвания за хронична диета.

Всички проучвания върху животни са одобрени от Комитета за грижи и употреба на животните в Университета в Чикаго и са напълно в съответствие с насоките на NIH за хуманно използване на животните. Налични са архивирани проби от предишни проучвания, взети от контролни мишки, хранени със стандартна диета (5% мазнини) или западна диета (20% мазнини) в продължение на 40 седмици (9). Пробите включват дистални сегменти на дебелото черво, фиксирани в 10% формалин или замразени в среда с оптимална температура на рязане (OCT), както и РНК и протеини от изолирана от остъргване лигавица на дебелото черво

Проучвания за остра западна диета

Експерименти с Marimastat и AMD3100.

Използвахме A/J мишки за остри диетични проучвания, тъй като планирахме да изследваме развитието на тумор на дебелото черво в модела AOM, който изискваше чувствителна към AOM мишка. Мъжки A/J мишки бяха имплантирани с помпи Alzet, доставящи 1,1 µmoles маримастат на ден на мишка в 50% полиетилен гликол (PEG) или 50% PEG само (контрол на носителя), или 0,126 µmoles AMD3100 на мишка на ден или вода (контрол на превозното средство) . Във всяка група имаше по 10 мишки. Маримастат е широкоспектърен инхибитор на металопротеазата, а AMD3100 е инхибитор на CXCR4 (21, 26). Мишките бяха оставени 48 часа да се възстановят след имплантиране на помпа и след това бяха хранени със западна диета (9). Мишките се умъртвяват след 2 седмици и оставят лигавицата на дебелото черво да се изолира и да замръзне. Кръговите сегменти (с дължина 3 mm) бяха замразени в OCT или фиксирани в 10% буфериран формалин и вградени в парафин за имунооцветяване. За проучвания AMD3100, мишките са инжектирани с бромодезоксиуридин (BrdUrd) 1 ml/100 g телесно тегло 2 часа преди умъртвяването, както е препоръчано от производителя.

Apc-мутант Мин проучвания на мишки.

Apc-мутантни Мишки на фона на C57Bl6/J, съдържащи отрязваща мутация в Apc codon 850, са получени от лабораторията Jackson (# 002020). Мишките са генотипизирани, както се препоръчва от лабораторията Джаксън. На 6-седмична възраст Min мишките (мъже и жени) бяха рандомизирани и хранени със западна диета (n = 20) или западна диета, допълнена с INCB3619 (n = 20; 860 mg/kg чау). INCB3619 се добавя като прах, смесен със захароза и осигурява 120 mg/kg телесно тегло/ден. Западната диета е описана по-рано (9). Мишки бяха умъртвени на 7-месечна възраст и тумори> 2 mm с размер бяха събрани в 4-сантиметрови сегменти от дванадесетопръстника, йеюнума и илеума и цялото дебело черво, както е описано по-горе (27). Туморите бяха събрани за протеини и РНК и сегменти, фиксирани във формалин за имунооцветяване. Контролните протеини и РНК се приготвят чрез изстъргване на изолация от безтуморна лигавица на дебелото черво и червата.

Проучвания на ADAM17 LoxP

Остри проучвания adeno-Cre ADAM17 LoxP.

Мишки с LoxP последователности, фланкиращи ADAM17 екзон 2, бяха получени от лабораторията The Jackson (номер на запас 009597) и генотипирани, както се препоръчва. За да потвърдим условно изтриване на ADAM17, ние лекувахме хомозиготни ADAM17LoxP мишки с интраректално adeno-Cre или adeno EV (контрол), както е описано по-горе (28). След 7 дни мишки бяха умъртвени и дисталните сегменти на дебелото черво замразени в ОСТ и оцветени за ADAM17.

Хронични проучвания за тумор на вилин-Cre ADAM17 LoxP AOM.

Хомозиготните ADAM17LoxP мишки, първоначално на фона на C57Bl6, бяха кръстосани 10 поколения с AOM-чувствителен A/J фон и съчетани с мишки, експресиращи вилин-Cre, които също бяха кръстосани 10 поколения с A/J фон. Експериментални мишки с вилин-Cre + -хомозиготни ADAM17 LoxP (ADAM17Δ/Δ) и контролирани хомозиготни мишки ADAM17 LoxP без липса на трансген на вилин-Cre бяха третирани с AOM 10 mg/kg телесно тегло седмично в продължение на 6 седмици. След това мишките бяха хранени със западна диета (9). Развитието на тумора се наблюдава чрез колоноскопия и мишките се жертват 24 седмици след първата инжекция с AOM (29). Дебелото черво се изрязва и туморите се класифицират хистологично от стомашно-чревен патолог (J. Hart). Индуцирани от AOM тумори и изолирана от изстъргване контролна лигавица от ляво дебело черво на мишки ADAM17LoxP, съвпадащи с генотип, третирани с физиологичен разтвор (AOM носител), бяха фиксирани в 10% формалин или бързо замразени в OCT или бързо замразени за екстракция на РНК и протеини.

Изолиране на колоноцити и стромални клетки от лигавицата на дебелото черво

Изолирахме колоноцити и стромални клетки след публикувани по-рано методи с незначителни модификации (30, 31). Накратко дебелото черво се отстранява и лигавицата се изолира и се смила с бръснач на 2 мм. Фрагментите бяха събрани в епруветки, съдържащи 6 ml стерилна ледено студена транспортна среда, 50 IU/ml пеницилин, 50 μg/ml стрептомицин и 0,5 mg/ml гентамицин. Тъканите се промиват три пъти чрез внимателна инверсия и се събират чрез гравитационно утаяване и се суспендират в 10-милилитров хелатен буфер (транспортна среда плюс 1 mmol/L EDTA и 1 mmol/L EGTA). Тъканта се инкубира върху шейкър за една нощ при 4 ° С, за да се освободят колоноцитите в супернатантата. Пелетата се промива три пъти с 3-милилитрово студен студен PBS, освобождавайки остатъчни колоноцити и супернатантите, съдържащи колоноцити, се комбинират. Епителните клетъчни фракции (супернатанти) и стромалните клетъчни фракции (пелети) се центрофугират при 400 × g в продължение на 5 минути при 4 ° С, като се получават хлабаво опаковани пелети, от които протеините се разтварят в 2 × буфер на Лаемли.

Клетъчна култура и разпространение

HCT116 и HT29 човешки ракови клетки на дебелото черво са получени в рамките на 6 месеца от ATCC и са удостоверени от ATCC, като се използват кратки тандемни повторни ДНК пръстови отпечатъци. Клетките се култивират при 37 ° C във влажна атмосфера от 5% CO2-95% въздух при условия, препоръчани от ATCC. За експерименти с трансактивация на EGFR, предварителните клетки бяха предварително обработени в продължение на 2 часа с 20 μg/mL антитела C225, 5 μmol/L BMS566394, 10 ng/mL AMD3100 или PBS (носител), последвано от 50 ng/mL CXCL12 или носител. Положителните контроли включват клетки, третирани с 10 ng/mL EGF. В посочените часове клетките се разбиват и лизатите се сондират за протеини чрез Western blotting.

PCR в реално време

РНК се екстрахира от бързо замразена тъкан с помощта на RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. Пробите се хомогенизират в смесител от куршуми и се зареждат в RNA-свързваща спинова колона, измиват се и се усвояват с DNase I и се елуират в 30-μL елуиращ буфер. Пробите се изследват с чип Agilent за чистота на РНК и се определят количествено от Ribogreen. РНК (100 ng) се транскрибира обратно в cDNA, използвайки комплект за обратна транскрипция с голям капацитет в общ обем от 20 μL. Инкубационните условия са 25 ° С за 10 минути, 37 ° С за 120 минути и 85 ° С за 5 минути. Получената първа верига комплементарна ДНК (cDNA) се използва като шаблон за количествена PCR в три екземпляра, използвайки Fast SYBR Green Master Mix Kit. Вижте допълнителни методи за повече подробности.

In situ оцветяване за TGFα транскрипти

Кръгови леви сегменти на дебелото черво (12 µm), замразени в OCT, се приготвят с криостат, поставят се върху пързалките Superfrost Plus, фиксират се в 4% параформалдехид в PBS за 20 минути и се промиват два пъти с DEPC-PBS за 5 минути. In situ хибридизация и откриване на TGFα транскрипти се извършва с помощта на Exiqon miCURY LNA антисенс олигонуклеотидни сонди, маркирани 5′- и 3′- с дигоксигенин (вж. Допълнителни методи за повече подробности).

Уестърн блотинг

Протеините се екстрахират в SDS-съдържащ буфер Laemmli, количествено се определя чрез RC-DC анализ на протеин и се подлагат на Western blot, както е описано по-горе (9). Нивата на експресия на протеини се изразяват като гънка на посочения протеин в чревна лигавица, изолирана от остъргване без тумор (Apc +/Min мишка), или лигавица на дебелото черво от третирани с физиологичен разтвор генетично съвпадащи ADAM17LoxP мишки (средно ± SD). Отделни аликвотни части бяха изследвани за β-актин.

Статистически анализ

Данните от денситометрията на Western blot бяха нормализирани като гънка на третирани с носител (клетки) или нормални лигавици (мишки) и изразени като средни стойности ± SD. Разликите между множество групи бяха оценени с ANOVA и след това разликите между конкретни групи бяха сравнени с помощта на несдвоен тест на Student t. Реакциите на обратната транскриптаза се провеждат в два екземпляра и се анализират в три екземпляра и стойностите на Ct са осреднени. Нетрансформираните стойности на Ct са сравнени между групи (33). Относителното изобилие, изразено като 2 ΔΔCt, се изчислява чрез степенуване на очакваните разлики в Ct и значимостта между групите, изчислени чрез тест на Student. Честотата на туморите се определя като процент на мишки с поне един тумор и се сравнява с помощта на точен тест на Fisher. Мултиплицирането на тумора се определя като средния брой тумори на тумороносната мишка и се сравнява с помощта на Mann-Whitney U тест. За всички статистически анализи стойностите на P ≤ 0,05 се считат за статистически значими.

Резултати

Западната диета регулира CXCL12 и EGFR сигналните компоненти

По-рано изследвахме ефектите от западната диета върху развитието на рак на дебелото черво (9). За настоящото проучване използвахме архивирани проби от контролното рамо на предишното проучване, за да дисектираме ефектите само от диетата върху EGFR сигналите. Изследвахме нивата на транскрипт и протеин на експресия на ADAM17, pro-TGFα и K-Ras в лигавицата на дебелото черво от контролни мишки. В допълнение, ние оценихме ефектите от диетата върху CXCL12, цитокин, замесен в рак на дебелото черво, който може да активира EGFR при други видове рак. Протоколът е показан на фиг. 1А. Западната диета значително увеличи транскриптите (фиг. 1В) и нивата на протеин на ADAM17, pro-TGFα и K-Ras, както и CXCL12 в дисталната лигавица на дебелото черво (фиг. 1С и D). In situ хибридизацията на TGFα mRNA показа, че транскриптите се експресират предимно в епителните клетки на дебелото черво (фиг. 1E и F), докато CXCL12 е най-разпространен в стромални клетки (фиг. 1G и H). Западните диети увеличиха нивата както на TGFα (фиг. 1B-F), така и на нивата CXCL12 (фиг. 1B – D, G и H).

EGFR сигналите изискват активност на металопротеаза и CXCR4 сигнали в западни мишки, хранени с диета

Маримастат.

Тъй като ADAM17 и няколко компонента на EGFR бяха увеличени в лигавицата на дебелото черво чрез западна диета, беше от интерес да се оцени ролята на ADAM17 в тези диетични ефекти. Тъй като специфичните ADAM17 инхибитори не се предлагат в търговската мрежа, ние избрахме маримастат, широкоспектърен инхибитор на металопротеазата, който блокира ADAM17 (26), за да оценим изискването за металопротеаза за EGFR сигнали при мишки, хранени със западна диета. Както е показано на допълнителна фигура S3, маримастатът значително инхибира EGFR сигналите в лигавицата на дебелото черво, с повече от 50% намаление на фосфоактивния EGFR (pEGFR), pErbB2 и pERK в сравнение само със западна диета. По този начин, EGFR сигнализирането в лигавицата на дебелото черво при западните мишки, хранени с диета, изисква металопротеазна активност. Тези резултати включват ADAM17 и вероятно ADAM10, тъй като те са основни ADAM, отговорни за регулирането на освобождаването на EGFR лиганд (22).