Защита на прерийните кучета (Cynomys ludovicianus) срещу чума след доброволно

ibg.waykun.com - Диета и загуба на тегло, днес

Джордан С. Менчър

Научна група за дивата природа, Университет във Вашингтон, Сиатъл, Вашингтон, 1 Американско геоложко проучване, Национален здравен център за дивата природа, Медисън, Уисконсин, 2 Heska Corporation, Ft. Колинс, Колорадо 3

Сюзън Р. Смит

Тим Д. Пауъл

Дан Т. Stinchcomb

Хорхе Е. Осорио

Тони Е. Рок

Резюме

Прерийните кучета (Cynomys spp.) Са силно податливи на Yersinia pestis и значителни резервоари от чума за хората в западната част на САЩ. Рекомбинантен миещ миещ мехур, експресиращ F1 антигена на Y. pestis, беше включен в вкусна стръв и беше предложен на 18 черноопашати прерийни кучета (Cynomys ludovicianus) за доброволна консумация; 18 животни с отрицателен контрол получиха плацебо примамки. Титрите на антителата срещу антигена на Y. pestis F1 са се увеличили значително (P 7 50% инфекциозни дози от тъканна култура (TCID50)/ml в среда на Ханкс (Gibco BRL, Карлсбад, Калифорния), допълнена с 5% глицерин (Sigma, St. Louis, Mo .) непосредствено преди употреба.

Наблюдението на хранителните предпочитания на прерийните кучета предполага, че сладкият картоф е най-вкусният зеленчук в тяхната лабораторна диета. Ситно настърган сладък картоф беше леко опакован в 10 g партиди в кладенци от пластмасови формички за лед и 8 ml течен желатин (9,3 g прахообразен желатин [Difco, Irvine, Calif.] В 150 ml затоплена среда на Ханкс) беше добавен, последван от 1 × 10 7 TCID50 от RCN-F1 ваксина/ml в 200 μl среда на Ханкс с глицерин. Ваксината се разбърква внимателно през течния желатин и сладки картофи. За примамките за отрицателен контрол в стръвта бяха вкарани 200 μl среда на Ханкс само с глицерин. След това подложките за лед се охлаждаха за 30 до 90 минути, докато желатиновите примамки се втвърдят.

За да се гарантира, че производството на стръв не намалява жизнеспособността на ваксинния вектор, вирусът се екстрахира от две натоварени с ваксини примамки в рамките на 24 часа след приготвяне чрез хомогенизиране и нискоскоростно центрофугиране. Извършена е идентична обработка на две примамки с отрицателен контрол, които не съдържат RCN-F1. Екстрахираните супернатанти се разреждат серийно (10 ×), добавят се клетки Vero и след 3 дни при 37 ° С и 5% СО2 ямките се оцветяват с трипан синьо и се наблюдават за нарушаване на монослоя на клетката Vero, съобразен с вирусния цитопатичен ефект ( CPE). Супернатантът от препарата за примамка с ваксина има титър 1 × 106 TCID50/ml в сравнение с 2 × 106 TCID50/ml за положителната контролна проба. Разликата между тези два титъра вероятно се дължи на непълно извличане на вируса от стръвта. Дори ако формулировката доведе до известно намаляване на вирусния титър, ние изчисляваме, че оралната консумация на една стръв излага на прерийното куче поне 2 × 106 TCID50 от ваксината RCN-F1/ml.

Прилагане на ваксина.

Осемнадесет прерийни кучета бяха разпределени на случаен принцип във всяка от двете изолационни стаи, за да служат като групи за отрицателен контрол и орална ваксинация. Четири допълнителни животни бяха разпределени в трета стая и получиха ваксината чрез i.m. инокулация (1 × 10 7 TCID50 от RCN-F1/ml в дясното бедро на ден 0 и ден 23) за потвърждаване на инфекциозността на ваксината. Групите не бяха съпоставени по пол или размер, въпреки че всички бяха възрастни.

Животните бяха подготвени за ваксинация чрез задържане на пресни зеленчуци за 48 h и гранулирана храна за 12 до 18 h. След това животните се идентифицират индивидуално чрез ушна марка и се поставят в носачи за домашни любимци с малък съд за храна, съдържащ единична стръв, натоварена с ваксина или без ваксина (плацебо), в зависимост от експерименталната група. След 2 до 4 часа всички животни бяха освободени и консумацията на стръв беше регистрирана за всеки индивид. Този процес беше извършен в дни 0 и 1 („първоначални ваксинации“) и в дни 26 и 27 за отрицателни контроли и дни 23 и 24 за ваксинирани („бустер ваксинации“). Повечето от животните са яли както примамки, така и подсилващи (Таблица (Таблица1). 1). Едно животно във всяка от ваксинираните и отрицателните контролни групи не успя да консумира поне една захранваща стръв, но след това изяде поне една стръв за подсилване. Едно животно от отрицателната контролна група не е изяло никакви примамки и е било елиминирано от по-нататъшни анализи.

МАСА 1.

Брой примамки, натоварени с RCN-F1, консумирани от пресни прерийни кучета (C. ludovicianus) във връзка с преживяемостта срещу Y. pestis предизвикателство, дни до смърт и титри на антитела към RCN и Y. pestis F1 и V антигени

Консумирани захранващи примамки Повишени консумиращи примамки Предварително предизвикателство за титъра на анти-RCN Предварително предизвикателство за титъра срещу F1 Оцеляване срещу предизвикателството Дни до смърт Анти-F1 титър след предизвикателството Анти-V титър след предизвикателството

2	2	375	12 800	Да	12 800	10 240
0	1	75	1600	Да	100	2,560
2	2	375	3200	Да	12 800	10 240
2	2	1,875	1600	Да	1600	2,560
2	2	375	800	Да	800	2,560
2	2	75	а	ND, не е определен.

Y. pestis предизвикателство.

Шест седмици след първоначалната ваксинация, всички животни бяха предизвикани с изолат от дивия тип CO92 на Y. pestis (предоставен от Института за инфекциозни болести на Американската армия). Основни аликвотни части от бактериите, приготвени и количествено определени, както е описано по-горе (16), бяха разредени 1000 пъти в стерилен физиологичен разтвор. Обем от 0,2 ml от този разтвор се прилага на всяко прерийно куче от s.c. инжекция в дясната тазобедрена област. Броят на плочите на предизвикващия инокулум показва доза от 132 000 CFU (6 600 миши 50% смъртоносни дози) и едновременни тестове на мишки потвърждават неговата вирулентност. Тъй като до 11 000 до 24 000 бактерии на ухапване могат да бъдат отблъснати от вектори на бълхи (3), нашата предизвикателна доза представлява приблизително тази, доставена от 6 до 12 инфекциозни ухапвания от бълхи. Преди този експеримент бяха направени няколко опита за определяне на 50% смъртоносна доза за нашия инокулум за предизвикване на Y. pestis при кучета с прерийни черни опашки (Rocke, непубликувано). Въпреки това, за разлика от самородните мишки, възпроизводими резултати не могат да бъдат постигнати с прерийни кучета. Прерийните кучета са били наблюдавани в продължение на 21 дни за признаци на заболяване или смърт, след което всички оцелели са били хуманно евтаназирани. Всички трупове бяха замразени за бъдеща аутопсия.

Степента на оцеляване на орално ваксинираните прерийни кучета се различава значително (P (Таблица1) 1) в сравнение само с 2 от 17 (11,8%) контроли, които са погълнали една плацебо стръв. За разлика от това, времето до смърт за онези животни, които не са оцелели, не се различава значително (P> 0,2) между ваксинираните и контролните групи чрез теста на Mann-Whitney (22). Въпреки че не са включени в нашите анализи, две от четири животни, ваксинирани чрез i.m. маршрут също оцеля предизвикателство.

Индуцираната от чума смъртност при предизвикани животни се проверява чрез изолиране на специфични за Y. pestis ДНК последователности от тъканна култура чрез PCR. Избрани замразени трупове бяха размразени и извадени, а пробите от тъкани от белия дроб, черния дроб и далака бяха култивирани в инфузионен бульон от мозъчно сърце (Difco) и върху плочи с кръвен агар (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) при 28 ° C до 72 ч. Впоследствие ДНК се екстрахира от културалния бульон и се съхранява при -20 ° C. За PCR бяха използвани праймери, специфични за гена Y. pestis F1 (12) за амплифициране на ДНК фрагменти, които бяха фракционирани и директно визуализирани с помощта на стандартни техники. ДНК фрагментите на Y. pestis бяха възстановени чрез PCR от белите дробове на 10 от 12 некропирани животни, които се поддадоха на чума, и от черния дроб или далака на 4 от 12. ДНК на Y. pestis не беше възстановена от никоя пробна тъкан от трите некропсирани животни, преживели предизвикателство.

Анти-RCN антитяло.

Кръвни проби (300 μl) бяха събрани от медиалната сафенозна вена на всяко прерийно куче преди първоначалното и подсилващите ваксинации и преди предизвикване; кръвни проби също са получени от оцелели след предизвикателството. Серумът се събира и съхранява при -20 ° C до анализи.

За определяне на серумните титри на анти-RCN антитела е използвана модификация на анализ за микронеутрализиране с нисък титър на антитела. Проби от серийни кучешки прерии се разреждат серийно и се тестват за способността да неутрализират 1 × 10 3 PFU/ml в микротитърни плаки. След инкубация в продължение на 2 часа при 37 ° С, инкубирани проби бяха добавени към дублиращи ямки на предварително засети 96-ямкови плаки, съдържащи Vero клетки. След допълнителна инкубация, фиксиране и оцветяване, CPE се оценява по отношение на ямките с отрицателен контрол и се записва най-високото разреждане на серума с намалена инфекция (25 до 50% намаление на CPE).

От 17 тествани ваксинирани всички разработени титри на анти-RCN антитела от 1:15 или по-високи (максимум, 1: 1 875) postboost (Таблица (Таблица 1); 1); серумът от един индивид не е изследван, тъй като е хемолитичен. Средният геометричен титър (GMT) на оралните ваксинирани е бил 1: 176, докато всички отрицателни контроли имат титри на анти-RCN антитела от 1: 12 800, третирани като равни на 1: 12 800.

Изходните титри на антитела срещу F1 антиген бяха всички (Таблица 1). 1). GMT след първоначалния GMT за орални ваксинирани е 1: 177, а техният postboost GMT е 1: 416. Реципрочните титри бяха log10 трансформирани и беше изчислена разликата в трансформирания титър на всяко животно от изходно ниво до postprime и от postprime до postboost. Титрите на антитела срещу F1 се увеличават значително при ваксинирани животни след началната доза (P Фиг. 1). 1). Тези данни показват, че доброволното поглъщане на натоварени с RCN-F1 примамки от прерийни кучета предизвиква хуморален имунен отговор към F1 протеин.

Оцеляване във връзка с титрите на антителата.

Логистичната регресия (14), начертаваща вероятността за оцеляване на предизвикателството срещу трансформирания титър на пост-бустер анти-F1 антитела, доведе до коефициент на вероятност 23 (95% доверителен интервал, 1,39 до 377,5), което показва слаба, но значима връзка (P 0,05). Титрите на антителата към F1 и V антигени, но не непременно и двете, повишават пост-предизвикателството при всички, освен при един оцелял от Y. pestis предизвикателство (Таблица (Таблица1 1).

Бяхме изненадани, че две неваксинирани животни са преживели предизвикателство със 130 000 CFU и вярваме, че това предполага, че вродената резистентност към Y. pestis може да се появи при някои прерийни кучета. Естеството на тази съпротива е неизвестно. Интересното е, че двете контролни животни, които са оцелели, предизвикаха високи титри на антитела към V антиген (2,560 и 10,240), но не и към F1 ( Андерсън, С. Х. и Е. С. Уилямс. 1997 г. Чума в комплекс от белоопашати прерийни кучета и свързани малки бозайници във Вайоминг. J. Wildl. Дис. 33 :720-732. [PubMed] [Google Scholar]

Популярен

Те четат сега

Защита на прерийните кучета с черна опашка (Cynomys ludovicianus) срещу чума след доброволна консумация на примамки, съдържащи рекомбинантна ваксина срещу енот поксвирус