Резюме

Заден план

Инфилтрацията на стромалната съдова фракция (SVF) на автоложна мастна тъкан за лечение на остеоартрит се използва от няколко години, демонстрирайки нейната безопасност и забележима ефикасност. Тази статия представя клинични данни от пациенти, засегнати от умерен и тежък остеоартрит на коляното, демонстриращи безопасност и клинична ефективност на лечението, когато този автоложен клетъчен продукт се инжектира в колянната става и пациентите се изследват след операцията след 1 година. Какво обаче знаем за механизма, който стои в основата на това клинично подобрение? Тази статия предлага за първи път според нас хипотеза за начина на действие, който включва структурни и молекулярни взаимодействия между SVF и инфрапателарна мастна подложка (IFP). В резултат на това би имало превъзпитание на вътреставната мастна тъкан, което считаме за ключов фактор за клиничния ефект, наблюдаван в средносрочен и дългосрочен план, главно поради имунорегулаторните механизми.

Методи

Това е ретроспективно и неконтролирано проучване, което оценява 50 пациенти (100 стави) на възраст от 50 до 89 години, разделени по възрастови кохорти. Клиничната ефективност е оценена с помощта на скалите Lequesne, WOMAC и VAS, чрез ултразвуков контрол и количествено определяне на биохимичните профили на синовиалната течност.

Резултати

Няма сериозни неблагоприятни ефекти. Всички изследвани индекси показват значително клинично подобрение след 1-годишно проследяване за всички възрасти и групи с ОА степен. Тази констатация е свързана с ехографските наблюдения и биохимичните данни, които показват значително намаляване на катаболните и провъзпалителни молекули (MMP-2, IL-1B, IL-6 и IL-8) и значително увеличение за анаболни и анти- възпалителни молекули (IGF-1 и IL-10).

Заключения

Ние заключаваме, че интраартикуларната SVF инфилтрация за лечение на ОА на коляното е безопасна и ефективна в продължение на 1 година. Предлагаме приложените SVF клетки да предизвикат каскада от молекулярни и структурни събития, които чрез сложни взаимодействия между IFP и SVF, превъзпитаване на вътреставната мастна тъкан към хомеостатична, защитна и противовъзпалителна функция, което в крайна сметка ще насърчи преструктуриране и регенерация на увредени тъкани.

Заден план

Проучването на EPISER потвърждава, че през 2020 г. остеоартритът на коляното (ОА) ще бъде четвъртата причина за увреждане в света и се смята, че в момента засяга около 5 милиона души в Испания, тъй като е хроничната патология, която изисква повече здравни ресурси. Смята се, че разпространението на гонартроза в Испания е 10,2% и че половината от населението на възраст над 50 години би имало радиологични признаци на тази патология. За хората на възраст между 60 и 69 години разпространението на симптоматичната гонартроза е 28,6% и 33,7% при тези над 70 години [1].

Има няколко проучвания, които се стремят да идентифицират механизмите на действие на МСК при ОА и много от тях демонстрират значението на паракринната активност на тези клетки във възпалителния процес и ремоделирането на извънклетъчния матрикс, дори предполагат, че има активиране на противовъзпалителен ефект на MSCs, причинен от патологичната, провъзпалителна микросреда на лезията [18,19,20,21]. Но по наше мнение няма подробен модел, който да описва начина на действие, включващ имуномодулиращи механизми, комбинирани със структурни и молекулярни синергии между SVF и инфрапателарна мастна подложка (IFP), като последният се приема като автентичен паракринен регулаторен орган, който е ключовият играч в развитието на болестта. От тази нова гледна точка настоящото проучване има за цел да оцени клиничната ефикасност на SVF вътреставно инжектиране при остеоартикуларна патология на коляното при 50 пациенти с двустранна ОА на коляното (н = 100), разделено на възрастови кохорти, както и обсъждане на възможния основен механизъм на действие.

Методи

Дизайн на проучването и разпределение на населението

Това ретроспективно и неконтролирано клинично проучване описва лечението на 50 пациенти (избрани на случаен принцип), които са посещавали нашата клиника между 2014 и 2016 г., на които е прилаган SVF интраартикуларно на двете колена и са завършили 1-годишния период на проследяване на лечението (без контролна група). Пациентите представиха остеоартрит на коляно III или IV степен (двустранно) по скалата на Kellgren-Lawrence, потвърдена от клинична оценка, ултразвук и ядрено-магнитен резонанс и/или рентгенография. Всички записани пациенти са се провалили с предишни конвенционални лечения, често използвани в Испанската национална здравна система и са били препоръчани за заместване на ставите с протеза. Всички пациенти, включени в това проучване, са били информирани в лично интервю от медицинския персонал с писмена информация, след което са подписали последващото информирано съгласие. Всички пациенти поемат разходите, свързани с лечението, с изключение на разходите, свързани с устройството за обработка на SVF и биохимичните определяния в синовиалната течност. Пациентите с тежки локални или системни проблеми бяха изключени.

Групата, подложена на лечение, се състои от пациенти на възраст между 50 и 89 години, засегнати от двустранна гонартроза степен III (50%) и степен IV (50%), от които 28 мъже и 22 жени, разпределени по възрастови кохорти (21 пациенти от 50 до 59 години, 17 от 60 до 69 години, 4 от 70 до 79 години и 8 от 80 до 89 години) и физическа оценка. Групата от 50 до 59 години съдържа 26 засегнати колена от степен III и 16 степен IV гонартроза, групата от 60 до 69 години съдържа 18 засегнати колена от степен III и 16 степен IV гонартроза, групата от 70 на 79-годишна възраст съдържа 4 колена, засегнати от гонартроза степен III и 4 от степен IV, а групата от 80 до 89 години съдържа 2 колена, засегнати от гонартроза степен III и 14 от степен IV.

Клинични резултати

Резултатите бяха оценени с помощта на анкети, докладвани от пациентите, използвайки скала за оценка на болката на визуалната аналогова скала (VAS) и индекса за остеоартрит на университетите в Западна Онтарио и Макмастър (WOMAC) и Lequesne Index [22] за оценка на заболяването при ОА преди лечение и след 3 месеца, 6 месеца и 1 година след инфилтрация на SVF.

Изолация на SVF

За получаване и обработка на мастна тъкан е използван търговският комплект ADSC System (Lyposmol Biotech, Мадрид, Испания) в строго съответствие с инструкциите на производителя. Накратко, на всеки пациент, включен в проучването, е извършен липоаспират под местна упойка (тумесцентен разтвор на Клайн; всички компоненти от B. Braun, Melsungen, Германия) на коремната област, за да се получат 60 ml мастна тъкан, която да бъде подложена на ензимно смилане с колагеназа I и II, за да се изолира чрез центрофугиране SVF. Полученият SVF беше ресуспендиран в Ringer Lactato (B. Braun) и присъствието на активна колагеназа преди инфилтрацията беше изключено с помощта на скрининговия тест, включен в същия комплект.

SVF характеристика

Като контрол на качеството, SVF клетките бяха преброени, използвайки метода за изключване на трипан синьо и беше използван с автоматичния брояч TC20 (Bio-Rad, Калифорния, САЩ) върху 10 μl аликвотна част, получена директно от SVF пробата.

За фенотипна характеристика чрез поточна цитометрия бяха взети аликвотни части от 0,5 ml от три независими проби, избрани на случаен принцип, за да се извърши лизис на еритроцити чрез хипосмотичен шок (ZenBio, NC, САЩ) и след това филтрирани през найлонова мрежа 50 μm. Полученият клетъчен разтвор се разрежда във фосфатен буфер без Ca2 + или Mg2 + (PBS, Merck KGaA, Дармщат, Германия) 1:10, за да се получи разреден разтвор на работеща клетка, който се инкубира в продължение на 15 минути при стайна температура и тъмно със следното конюгирани с флуорохром антитела: CD45-FITC, CD31-PE, CD34-PerCP и CD146-PerCP (всички от Sysmex, Kobe, Япония). За изключване на мъртвите клетки е използван DAPI и за изключване на дублети са изправени пред параметрите за размер и площ. За регулиране на напреженията и компенсациите са използвани съответните контроли (съответно спрягани изотипове и маркери един по един). За получаване на пробите е използван поточен цитометър BD FACSCelesta (Becton Dickinson, NJ, USA), оборудван със софтуера BD Diva (Becton Dickinson). За анализ на резултатите е използван текущ софтуер 2.5.1 (Perttu Terho, Турку, Финландия).

Екстракция на синовиална течност и анализ на молекулярния профил

Като допълнение към клиничните данни, наблюдавани по време на проследяването на пациенти, лекувани с интраартикуларна SVF инфилтрация, ние определихме количествено синовиалните нива на провъзпалителни цитокини (IL1β, IL6 и IL8), противовъзпалителни цитокини (IL10), катаболни (MMP2) и анаболни (IGF1) фактори, преди и 12 месеца след лечението. Накратко, 1 до 2 ml синовиална течност бяха получени с помощта на 21G игла (Becton Dickinson). Веднага след екстракцията, той беше замразен при - 80 ° C в криовиали (Eppendorf, Хамбург, Германия) до количествено определяне. Тестовете ELISA бяха проведени в съответствие с инструкциите на производителя (всички получени от Wuhan Fine Biotech Co., Wuhan, Hubei, China) и количествено определени в Microplate Absorbance Reader (iMark TM, BioRad, Hercules, CA, USA).

SVF инфилтрация

Обемът на SVF клетъчната суспензия на колянната става се коригира на 7 ml с помощта на лактиран рингер и след това се инжектира вътреставно (и в мазнината на Hoffa или IFP) с помощта на инжекция с ултразвуково управление с игла 21 (Becton Dickinson).

Статистически анализ

Значението (стр

Резултати

Клинични резултати

Във всички използвани скали и изследвани възрастови кохорти открихме статистически значими разлики между изходното ниво и оценката след 12 месеца (стр Фиг. 1

клетки

Общият резултат на WOMAC е 41,04 (средни стойности) за пациенти с остеоартрит III степен и 52,8 за тези с IV степен, като се получава окончателно средно 12 месеца след имплантиране на SVF от 6,18 за пациенти с ОА степен III и 23,8 за степен IV (фиг. 1в, д).

Оценката на болката, използваща индекса VAS, показа значително намаляване във всички възрастови групи. Първоначалните средни стойности са 7,08 за степен III остеоартрит и 7,70 за степен IV, регистрирайки крайна средна стойност на споменатия индекс от 2,12 на 12 месеца след имплантацията за степен III и 3,96 за степен IV (Фиг. 1д, f).

Ако анализираме еволюцията на болката, като изучаваме средната стойност, получена в резултатите от трите скали, използвани при нейната оценка, наблюдаваме, че в групата на гонартроза III степен има средно процентно намаление на болката от 74,44% на 12 месеца след извършване вътреставната имплантация на SVF. В групата на гонартроза IV степен, средно процентно намаление от 54,11% на намаляване на болката се наблюдава 12 месеца след имплантацията. Най-високото възприятие за подобрение в групата с ОА степен III се запазва, ако анализираме индекса на удовлетвореност. Средният процент на удовлетвореност на пациентите, независимо от тяхната възраст (изразен като процент), е бил 85,8% в групата на гонартроза III степен и 76,2% в групата на гонартроза IV степен.

По отношение на ултразвуковия контрол, изследването на яснотата и целостта на интерфейса мека тъкан-хрущял показа леко подобрение в група IV степен и ясно подобрение в група III степен. Не се наблюдават значителни промени в никоя група по отношение на измерването на дебелината. По отношение на ултразвуковата оценка на синовиалния излив се наблюдава очевидно подобрение в група III степен, като това подобрение е по-малко в група IV степен (Фиг. 2а, b).

Молекулен профил на синовиалната течност

Катаболните и анаболните профили, наблюдавани в синовиалната течност чрез измерване на нивата на металопротеиназа 2 (MMP2) и инсулиноподобен растежен фактор тип 1 (IGF1), намаляват съответно с 80,24% и нарастват с 330,64%. Аналогично, анализирането на профилите на противовъзпалителни и противовъзпалителни процеси, наблюдавани в синовиалната течност чрез оценка на противовъзпалителни цитокини (IL1β, IL6 и IL8) и противовъзпалителни цитокини (IL10), намалява с 32.26% в случая на IL1β, 58,25% в случая на IL6 и 36,77% в случая на IL8 и нараснали в 70,80% в случая на IL10 (фиг. 2в, г). Всички резултати на фигурите са изразени като пикограми на милилитър синовиална течност.

SVF характеристика

След извършване на предишно разреждане, броят на ядрените клетки, присъстващи в оригиналните проби, е 3,21 × 10 6 ± 0,44 × 10 6 на милилитър, със средна жизненост (жизнеспособност) от 82 ± 9%.

Резултатите от фенотипната характеристика на три представителни SVF проби са отразени на фиг. 2д. Експресията на различни маркери е показана в проценти по отношение на общите ядрени клетки.

Дискусия

Клиничен ефект на SVF при ОА на коляното

Използването на SVF има голям потенциал като терапевтичен агент в регенеративната медицина, особено при ортопедични приложения при хора. Предварителните клинични проучвания показват, че употребата му е безопасна и ефективна при лечението на остеоартрит [25, 26], което се възпроизвежда в нашето проучване, в което безопасността и ефикасността са оценени чрез наблюдение на пациентите в продължение на 1 година. Наблюдаваните нежелани реакции са леки и преходни, най-вече коремен дискомфорт, свързан с процедурата за липосукция. Както и в други проучвания, не сме открили тежки усложнения при пациенти в напреднала възраст [27]. По отношение на инфилтрацията на SVF, най-честият неблагоприятен ефект е лекият и преходен синовит, вероятно причинен от инжектирания обем, както е описано от други автори [28]. Някои недостатъци на тази техника са времето за обработка от събирането на тъкани до изолирането на SVF (60–90 минути), а в някои случаи и трудности при получаване на достатъчен обем липоаспират от много слаби пациенти (нисък индекс на телесна маса).

Оценка на синовиалната течност и етиология на ОА

От биохимична гледна точка, резултатите от анализа на синовиалната течност показват промяна в молекулярния профил към противовъзпалителен фенотип и следователно съответстват на наблюдаваните клинични и ултразвукови подобрения. Не успяхме да намерим еквивалентно проучване, проведено при същите условия, за да сравним резултатите, но други автори също са изследвали биохимични профили в подобни ситуации, получавайки сравними резултати [32,33,34,35,36,37]. Нещо повече, дори при различно лечение, например с хиалуронова киселина, също се наблюдава промяна в цитокиновия профил към този типично противовъзпалителен фенотип [38]. Всички тези резултати изглежда показват, че клиничното подобрение, наблюдавано при ОА, независимо от лечението, може да бъде свързано с модифицирани молекулни профили в синовиалната течност извънредно.

Инфрапателарна мастна подложка като основен двигател на патофизиологията на ОА на коляното

SVF кръстосани препратки

Въпреки че MSCs по принцип носят най-голямата биологична сила, терапевтичният ефект на SVF клетките върху прогресията на OA с всички налични клетки и синергията между тях и третираната тъкан също могат да бъдат включени.

Заключения

Ние заключаваме, че интраартикуларната SVF инфилтрация за лечение на ОА на коляното е безопасна и ефективна. Предлагаме, че приложените SVF клетки предизвикват каскада от молекулярни и структурни събития, които чрез сложни взаимодействия между IFP и SVF превъзпитават вътреставната мастна тъкан към хомеостатична, защитна и противовъзпалителна функция. Този механизъм в крайна сметка ще насърчи преструктурирането и регенерацията на увредените тъкани.

Би било желателно да се проучи и оцени, при животински модел на ОА на коляното и с белязани SVF клетки, прогресията по различно време на хистопатологичните промени в IFP, ставния хрущял и синовиалната мембрана и течност, за да може да се разбере в дълбочина наблюдаван терапевтичен ефект. Това би позволило да се опровергае или потвърди предложената хипотеза.

Наличност на данни и материали

Данните и материалите са удобно обяснени в основния текст. Ако някой читател се нуждае от допълнителни данни, той може да пише свободно на съответния автор.