Мари-Аделин Маркис

a Inserm, UMR 1048, Лаборатория за изследване на затлъстяването, Институт по сърдечно-съдова и метаболитна медицина

механичен

b IFR150, Федерален институт за биомедицински изследвания в Тулуза, Университет Пол Сабатие, Университет в Тулуза, Тулуза

Марион Комбс

a Inserm, UMR 1048, Лаборатория за изследване на затлъстяването, Институт по сърдечно-съдова и метаболитна медицина

b IFR150, Федерален институт за биомедицински изследвания в Тулуза, Университет Пол Сабатие, Университет в Тулуза, Тулуза

Балбин Русел

a Inserm, UMR 1048, Лаборатория за изследване на затлъстяването, Институт по сърдечно-съдова и метаболитна медицина

b IFR150, Федерален институт за биомедицински изследвания в Тулуза, Университет Пол Сабатие, Университет в Тулуза, Тулуза

Лорънс Видал-Дюпон

c Физиотерапевтичен център, Saint-Orens de Gameville, Тулуза

Клер Таламас

a Inserm, UMR 1048, Лаборатория за изследване на затлъстяването, Институт по сърдечно-съдова и метаболитна медицина

d Център за клинични изследвания Inserm CIC-9302, Университетски болничен център в Тулуза, Франция

Макс Лафонтан

a Inserm, UMR 1048, Лаборатория за изследване на затлъстяването, Институт по сърдечно-съдова и метаболитна медицина

b IFR150, Федерален институт за биомедицински изследвания в Тулуза, Университет Пол Сабатие, Университет в Тулуза, Тулуза

Натали Вигери

a Inserm, UMR 1048, Лаборатория за изследване на затлъстяването, Институт по сърдечно-съдова и метаболитна медицина

b IFR150, Федерален институт за биомедицински изследвания в Тулуза, Университет Пол Сабатие, Университет в Тулуза, Тулуза

Резюме

Заден план

Известно е, че зоните на глутеофеморалната мастна тъкан са слабо метаболитно реактивни. По-рано се съобщава, че механичният масаж показва морфологично и функционално въздействие върху тази тъкан. Настоящото проучване беше проведено, за да се задълбочи по-задълбочено в механистичните съображения относно честотата на механична масажна техника върху профила на генна експресия и β-адренергично медиирана мобилизация на липиди в женската бедрена мастна тъкан.

Методи

Включени са 12 здрави жени в пременопауза, които са получили 12 сесии на калибриран механичен масаж (Endermologie®). Обща РНК беше извлечена от биопсии на мастната тъкан на бедрената кост за изследвания на генната експресия. Микродиализата се провежда в бедрената мастна тъкан, за да се оцени липолитичната реакция (чрез определяне на глицерол) и промените в локалния кръвен поток след перфузия на липолитичен агент, изопротеренол. Оценките бяха извършени преди и след 6-седмичния експериментален период.

Резултати

Механичният масаж инициира важни модификации в профила на генна експресия. Мобилизиращият липидите ефект на изопротеренол се засилва след експерименталния период. Базалният локален кръвен поток и индуцираната от изопротеренол вазодилатация също бяха подобрени.

Заключение

Протоколът за механичен масаж, използван в проучването, насърчава забележими промени в експресията на гени, участващи в метаболитните пътища. Липолитичните и локалните реакции на кръвния поток на мастната тъкан, инициирани от изопротеренол, бяха значително подобрени.

Въведение

Планирани са експерименти за изследване на въздействието на масажа върху профилите на генна експресия, използвайки високопроизводителни методи за генна експресия. В допълнение бяха проучени модификации на индуцирана от изопротеренол липидна мобилизация и промени в кръвния поток, използвайки in situ микродиализа преди и след 12 сесии на калибриран механичен масаж.

Материали и методи

Субекти

Дванадесет здрави кавказки жени в пременопауза (средна възраст: 31,8 години) бяха наети в Центъра за клинични изследвания в Тулуза, CHU Purpan, Тулуза, Франция. Всички жени са имали гиноиден морфотип със следните характеристики: височина 1,60 m (95% доверителен интервал (CI): 1,60–1,70); тегло: 70,7 kg (95% CI: 66,8–74,5); индекс на телесна маса (ИТМ): 26,8 kg/m 2 (95% CI: 26,0–27,5); съотношение талия/ханш: 0,80 (95% CI: 0,79–0,82). Всички те са били очевидно здрави с нормални биологични параметри в плазмата и са били под контрацептивно лечение. Критериите за изключване включват диабет, бременност, хипертония, дислипидемия, лечение с антидепресанти и употреба на лекарства за отслабване. На всички субекти беше казано да поддържат обичайната си диета за цялото времетраене на проучването. Никой не е участвал в програми за тренировка за физическа активност или протоколи за ограничаване на калориите. Разследванията са одобрени от Комитета по етика на университетските болници в Тулуза и всички субекти са дали писмено информирано съгласие.

Уча дизайн

Дизайнът на проучването е обобщен в диаграмата, изобразена на фигура 1. Набирането на пациенти, GAT биопсии и експерименти за микродиализа бяха извършени в Центъра за клинични изследвания, CHU Purpan, Тулуза, Франция. Биохимичните определяния и анализите на транскриптома бяха извършени в лабораторията за изследване на затлъстяването, CHU Rangueil, Тулуза, Франция.

График на механичен масаж

Техниката на механичен масаж (Endermologie ®) се извършва от експертен физиотерапевт с опит в оптимизираното използване на масажното устройство. Всеки субект получи общо дванадесет 30-минутни сесии (два пъти седмично) на механичен масаж (фиг. 1). Масажното устройство се състои от третираща глава, в която два независимо моторизирани валяка са комбинирани със смукателна система, позволяваща многократно мобилизиране на кожната и подкожната тъкан (Cellu M6; LPG Systems, Valence, Франция). Тъй като изследванията, посветени на морфометрията (т.е. измервания на обиколката и кожните гънки преди и след лечението) са докладвани в предишно проучване [15], настоящото беше фокусирано върху биологичните отговори. Счита се, че определянето на морфометрията е извън обхвата на протокола.

GAT биопсия и подготовка на обща РНК

Биопсиите на GAT бяха получени чрез аспирация с игла под местна упойка след еднонощно гладуване и съхранявани при –80 ° C до края на програмата. Общата РНК от замразени биопсии се приготвя, както е описано по-рано [22], като се използва RNeasy total RNA Mini kit (Qiagen, Courtaboeuf, Франция). Общата концентрация на РНК и качеството на РНК се определят чрез капилярна електрофореза с помощта на анализатор Experion (BioRad, Marnesla-Coquette, Франция).

Етикетиране на сонда и анализ на микрочипове

Целевата РНК се генерира от 500 ng обща РНК с комплекта за усилване на Agilent с ниска РНК (Agilent Technologies, Massy, ​​Франция). Cy3 (преди) и Cy5 (след 12-те сесии) сонди от същия обект бяха пречистени и хибридизирани до цели геномни 4 × 44 k олигонуклеотидни масиви (Agilent Technologies), както е описано в [19]. Събирането на данни се извършва със скенер InnoScan 700 (Innopsys, Carbonne, Франция) и изображенията се обработват със софтуера Mapix (Innopsys). Хибридизацията беше проверена с качество, използвайки контролни пикове. Отстранени реплики и петна със съотношение сигнал/шум по-малко от 2 както на червения, така и на зеления канал бяха отстранени от анализите, което доведе до 18 466 експлоатационни петна. Данните за съотношението на логаритъма бяха нормализирани с глобална процедура на Loess и филтрирани с R пакета LIMMA (Bioconductor). Анализът на основните компоненти беше използван, за да се провери дали всички експерименти с микрочипове предоставят последователни данни. Диференциалните гени бяха търсени с помощта на еднокласната процедура за анализ на значимостта на микрочипове (SAM) [23]. Функционалният анализ беше направен с помощта на Ingenuity Pathway Analysis (IPA) версия 8.6 [24], като целият геном на Agilent беше зададен за справка.

Количествена PCR в реално време

Обратната транскрипция (RT) беше извършена, използвайки 1 µg обща РНК, произволни хексамери и поли (dT) съгласно комплекта за обратна транскрипция cDNA с голям капацитет (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) [19]. Анализи TaqMan ® (Приложни биосистеми) бяха използвани с 18S (Тестове за контрол на Taqman ®; Приложени биосистеми) за нормализиране на генната експресия.

Експерименти с микродиализа

Биохимични определяния

Глицеролът в диализата се анализира чрез ензимен метод (Sigma, Saint Louis, MO, USA), както е описано по-рано [26]. Коефициентът на вариация в интраанализата (CV) е бил 7.6–8.0%, а интерактивният CV е 8.8–9.6%. Етанолът в диализат и перфузат (5 µl) се определя с ензимен метод [27]. Интра- и интерактивното CV е съответно 3,0% и 4,5%.

Конвенционален статистически анализ

Всички стойности на липолитичните анализи са представени като средни стойности ± SEM. Статистическият анализ беше извършен с помощта на SPSS за Windows 17.0 (SPSS Inc, Чикаго, IL, САЩ). Резултатите от непараметричния сдвоен тест на Wilcoxon се считат за значими, ако p 2 = 0,9198).

Процедурата по подбор доведе до 1014 регулирани нагоре и 1245 регулирани надолу транскрипти, включително 691 гена (509 нагоре и 182 надолу регулирани) с ниво на експресия, по-голямо от 1,5 пъти промяна. 1 903 гена с допустими идентификатори, които са картографирали базата данни IPA, са представени в допълнителната таблица (на http://content.karger.com/ProdukteDB/produkte.asp?doi=327347).

Както е посочено в таблица 3, най-високо класираният каноничен път на IPA е „глицеролипиден метаболизъм“, като 73% от гените са регулирани надолу. Четири други пътища, свързани с метаболизма, също са значими, „метаболизъм на пропраноат“, „гликолиза/глюконеогенеза“, „цитратен цикъл“ и „метаболизъм на пирувата“, които се състоят от 81, 68, 100 и 73% от регулираните надолу гени, съответно, както е показано на фигура 4.

Онтологията на IPA също така избра списъците „митохондриална дисфункция“ и четири пътища за трансдукция на сигнала с повече от две трети от гените, които са регулирани надолу, с изключение на този за „хемокинова сигнализация“, който съдържа две трети от регулираните нагоре гени. Списъците на „апоптоза“ и „сигнализиране за остра фаза на отговор“ обхващат доста сходен брой регулирани нагоре и надолу гени (съответно 41 и 55% от гените с по-високо ниво на експресия).

Промени в индуцираното от изопротеренол освобождаване на глицерол в GAT, предизвикано от повтарящ се механичен масаж

Изходният базален глицерол, получен по време на инфузията само на разтвор на Рингер в контролната сонда, е стабилен по време на експерименталния период. Стойностите на глицерола, определени в контролните сонди, бяха взети предвид за изчисляване на изхода на глицерол в стимулирани условия. Зависим от концентрацията прираст на изхода на глицерол се наблюдава по време на инфузията на изопротеренол преди лечението (фиг. 2). След сесиите за механичен масаж бяха извършени предизвикателства с изопротеренол (поне 24 часа) след последната сесия на масаж. Средните стойности на индуцирания от изопротеренол глицерол при 1 и 10 µmol са значително увеличени в сравнение със стойностите, получени преди масажните сесии (фиг. 2).