Отдел за изследване на партньорството Молекулярна биология, Лайбниц институт за биология на селскостопански животни (FBN), Dummerstorf, Германия

влияе

Отдел за изследване на партньорството Молекулярна биология, Лайбниц институт за биология на селскостопански животни (FBN), Dummerstorf, Германия

Отделение за изследователска дейност Физиология на храненето, Лайбниц институт за биология на селскостопански животни (FBN), Dummerstorf, Германия

Изследователска група за партньорство Функционална геномика, Лайбниц институт за биология на селскостопански животни (FBN), Dummerstorf, Германия

Отдел за изследване на партньорството Молекулярна биология, Лайбниц институт за биология на селскостопански животни (FBN), Dummerstorf, Германия

  • Майкъл Остър,
  • Едуард Мурани,
  • Корнелия С. Меджес,
  • Сирилук Понсуксили,
  • Клаус Вимерс

Фигури

Резюме

Цитат: Oster M, Murani E, Metges CC, Ponsuksili S, Wimmers K (2011) Високопротеинова диета по време на бременност засяга експресията на чернодробни гени на енергийно чувствителни пътища по онтогенеза в свински модел. PLoS ONE 6 (7): e21691. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0021691

Редактор: Винсент Лодет, Ecole Normale Supérieure de Lyon, Франция

Получено: 6 декември 2010 г .; Прието: 26 май 2011 г .; Публикувано: 18 юли 2011 г.

Финансиране: Изследването е част от проекта FEPROeXPRESS (FUGATOplus (http://www.fugato-forschung.de/), FKZ 0315132A), който се финансира от Федералното министерство на образованието и научните изследвания на Германия. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Резултати

Сравнения между HP и AP на етапи

Числата в хоризонталните стрелки показват количеството на наборите сонди, значително регулирани между съседните онтогенетични етапи в потомството на AP или HP, докато числата в кръстовищата показват количеството на наборите сонди, които обикновено се регулират между етапите в AP и потомството на HP. Числата при вертикалните стрелки са броят на наборите сонди, диференцирано изразени между потомството на AP и HP на същия онтогенетичен етап (стрелките между кутиите показват посоката на сравненията; малки стрелки отгоре = регулирани нагоре, малки стрелки отдолу = надолу- регулирани комплекти сонди).

Разлики в надлъжната онтогенетична регулация сред потомството на HP и AP

Изброените пътища между етапите в потомството на AP (бели кутии) показват подходящото онтогенетично развитие, което не се случва в потомството на HP (черни кутии) в съответния период на развитие. Пътищата между етапите на HP показват процеси и метаболитни регулации, които се случват в поколението на HP, но не и в поколението на AP в съответния период на развитие. Разликите в генната регулация в зависимост от диетата и онтогенетичния стадий показват програмиране на плода по отношение на нарушения в развитието и метаболизма (стрелките между кутиите показват посоката на сравненията; малки стрелки отгоре = регулирани нагоре, малки стрелки надолу = регулирани надолу пътища; mTOR, мишена на рапамицин за бозайници; RAN, свързан с Ras ядрен протеин; IGF-1, инсулиноподобен растежен фактор; PPAR, рецептор за пролифератор на пероксизома; AMPK, AMP-активирана киназа).

Сред TFs, за които е установено, че са свързани с гените, регулирани поради гестационните диети при майките на различни етапи на развитие на потомството, 40 са излишно намерени сред първите 10 TF, подчертани от DiRE за различните направени сравнения. Установено е, че само HNF4A, DR1, STAT6 и TCF4 са диференцирано регулирани поради диета и етап.

За всички гени, анализирани с пример, qRT-PCR потвърждава посоката на диференциално регулиране, получена чрез анализ на микрочипове. В 80% от гените, които потвърдихме чрез qRT-PCR, значителни експресионни разлики в нивата на иРНК между лекуваните групи бяха идентифицирани както чрез qRT-PCR, така и чрез анализ на микрочипове. Корелациите между експресионните стойности на микрочипове и qRT-PCR варират между 0,43 и 0,84 и са много значими (Таблица 3). Това предполага, че нашите данни от микрочипове са надеждни.

Дискусия

Данните предоставят моментна снимка на транскриптома, така че остава неясно до каква степен транскриптомните различия, наблюдавани на пред- и перинаталния етап между експерименталните групи, се дължат на хронични дългосрочни ефекти или на остри стимулиращи събития в живота, като раждане или отбиване. Интересното е, че потомството при 28 dpn показва намален брой диференциално експресирани иРНК в сравнение с етап 1 dpn. Към този момент потомството на HP може да е адаптирало своите профили на експресия към ранните условия след раждането по време на отбиването. Въпреки това, броят на диференциално експресираните набори от сонди се увеличава отново на възрастен етап. Нашият модел показва, че гестационните HP диети повлияват краткосрочно и дългосрочно на профилите на експресия при потомството на HP. Ефектът се характеризира с ангажиране на генома, което води до различна отзивчивост и адаптивност на механизма за генна експресия към хронични и остри дразнители от околната среда. Поради диетата на HP редица пътища за отчитане, производство и използване на енергия са важни в тези процеси.

Окислително фосфорилиране и митохондриални метаболитни пътища

Сигнализиране за вътреклетъчен метаболизъм

MTOR сигнализацията действа като важен хранителен път, който контролира протеиновия синтез в клетките на бозайници на нивото на транслация [46]. Сигналите нагоре по веригата на mTOR сигнализирането включват промени в наличността на аминокиселини, изобилие от хормони, AMP и растежни фактори [47]. По този начин, mTOR сигнализирането участва в регулирането на индивидуалния клетъчен растеж, ефективността на растежа и процесите на развитие [48], [49]. Увеличение на mTOR сигнализирането от фетален до неонатален стадий се наблюдава при АП потомство без промяна в групата на HP. Това може да обясни намален протеинов синтез в потомството на HP и по този начин да допринесе за наблюдаваното забавяне на растежа и променен метаболитен статус, както се предлага от Inoki et al. [50]. В допълнение, mTOR сигнализирането може също да участва в процесите на компенсаторен растеж. Следователно, зависимата от диетата диаметрална регулация на свързаните с mTOR сигнализиране на гени между млади и възрастни свине може да се тълкува като успешна компенсация по отношение на ефективността на растежа. Успехът на компенсаторните процеси в потомството на HP става очевиден от факта, че теглото им е било намалено на етапи 94 dpc и 1 dpn в сравнение с групата AP, но подобни на етап 188 dpn.

Сигнализирането на растежния хормон, друг сигнал за анаболен растежен фактор, регулира метаболитните процеси, включително синтеза на протеини и има важни регулаторни ефекти върху метаболизма на протеините, въглехидратите и липидите [59]. Нивата на тРНК на транскриптите, свързани със сигнализиране на растежен хормон, показват двуфазна регулация по време на развитието на потомство на HP. Следователно, наблюдаваната надолу регулация на свързаните с гените за сигнализиране на растежен хормон при раждане и тяхното регулиране нагоре към младежки и възрастни етапи съответстват на забавянето на растежа на етапи 94 dpc и 1 dpn и компенсаторния растеж напред в зряла възраст.

Глюкокортикоидите, основен подклас на стероидните хормони, регулират голям брой метаболитни, поведенчески, сърдечно-съдови и имунни функции. Техният биологичен ефект се модулира от глюкокортикоидния рецептор с последващи директни и индиректни взаимодействия на целевите гени надолу по веригата, за да модулират генната експресия. Сигнализирането за глюкокортикоиден рецептор прекратява стресовите реакции и мобилизира енергийните ресурси за тази цел. Експресията на тРНК на гени, свързани с сигнализирането на глюкокортикоидни рецептори, е показана, че зависи от диетата на майките с гестационен протеин [2], [60], [61]. Двуфазното регулиране на сигнализирането на глюкокортикоидните рецептори в пренаталното, перинаталното и младежкото потомство на НР подчертава постулираната повишена реакция на стрес при потомството на НР при раждането, което може да се натрупва в наблюдаваните нарушения на митохондриалната активност. Освен това, зависимото от диетата регулиране на сигнализирането на глюкокортикоидния рецептор между младежкия и възрастния стадий и произтичащото повишено сигнализиране за глюкокортикоиден рецептор на етап 188 dpn при потомство на HP предполага, че потомството на HP е било в вид аларма (активирана защита) на възрастен етап.

Поддържане и разпространение на клетки

Поддържане и пролиферация на клетките RAN, член на семейството Ras на малки GTPases, е положителен ключов регулатор на митозата [62] и играе критична роля в множество клетъчни функции, включително нуклеоцитоплазмен транспорт, сглобяване на ядрена обвивка и образуване на вретено по време на клетъчния цикъл [63]. Следователно, RAN сигнализацията участва в клетъчния растеж и процесите на развитие. Диетата и зависимата от етапа експресия на RAN сигнализиране бяха частично диаметрално регулирани по протежение на онтогенетичното развитие (между етапи 94 dpc срещу 1 dpn и в рамките на етап 1 dpn), което представлява адаптация към различни пренатални условия. Почти подобна посока на регулиране на гените, участващи в RAN сигнализирането, беше открита на младежки и възрастни етапи (между етапи 28 dpn срещу 188 dpn и в рамките на етап 188 dpn), което може да отчете компенсаторните процеси.

Пътищата, касаещи метаболизма на пурин и пиримидин, са свързани с редица процеси, включително нуклеотиден биосинтез, разграждане и спасяване. Намаляването на регулацията на гените, свързани с метаболизма на пурин и пиримидин, вероятно е причина за намален клетъчен оборот на етап 188 dpn в сравнение с етап 28 dpn при потомството на HP. GADD45B, ген, чиято транскрипция се индуцира в отговор на множество фактори на околната среда и физиологичния стрес, участва в възстановяването на ДНК, апоптозата, оцеляването на клетките и спирането на растежа [64]. Експресията на тРНК на GADD45B се увеличава в потомството на HP на етап 188 dpn, което предполага метаболитен приоритет за оцеляване на клетките и прекратена ефективност на компенсаторния растеж на възрастен етап.

Валин, левцин и изолевцин са незаменими аминокиселини с разклонена верига. Катаболизмът и на трите аминокиселини споделя едни и същи ензими през първите стъпки, включително трансаминиране и декарбоксилиране. Като краен резултат се получават три различни производни на CoA, които могат да бъдат насочени към синтеза на стероиди или кетонни тела и към цитратния цикъл. Регулирането надолу на гените, свързани с разграждането на валин, левцин и изолевцин в потомството на HP на етапи 1 dpn и 28 dpn, може да съответства на по-голямо търсене на тези аминокиселини, отколкото при потомството на AP. Въпреки това, потомството на HP повишава експресията на гени, участващи в разграждането на валин, левцин и изолевцин по време на развитието след отбиването, което води до непроменено ниво на експресия на етап 188 dpn между диетичните групи.

Заключение

Гестационните HP диети засягат профилите на чернодробната експресия в пренаталния и постнаталния стадии. Ефектите обхващат пристрастие на генома, което води до променена реакция на пътищата за чувствителност на енергия и хранителни вещества. Очевидно програмирането на геномите изисква адаптации и компенсаторен растеж, но вероятно за сметка на предразположението към метаболитни нарушения до стадий на възрастни. За да се тества тази хипотеза, свинският модел може да се използва в експеримент, при който потомството на свине майки, хранени с различни гестационни диети, също се възразява срещу различни диетични предизвикателства на постнаталния етап.

Материали и методи

Животни и събиране на проби

Изолиране на РНК, приготвяне на мишена и хибридизация

Съгласно протокола на производителя общата РНК от отделни чернодробни проби е изолирана с помощта на Tri-Reagent (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Германия). След третиране с DNase се извършва пречистване на базата на колона с помощта на RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия). Пробите от РНК се визуализират върху 1% агарозни гелове, съдържащи етидиев бромид, за да се провери целостта на РНК. РНК се определя количествено чрез спектрометрия със спектрофотометър NanoDrop ND-1000 (PEQLAB, Erlangen, Германия). За да се гарантира липсата на замърсяване на ДНК в изолираната РНК, беше направено PCR усилване с гена на свински глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) (Праймер: AAGCAGGGATGATGTTCTGG; Обратен праймер: ATGCCTCCTGTACCACCAAC). Всички проби от РНК се съхраняват при до извършване на анализ надолу по веригата. За експериментите с микрочипове, индивидуална белязана с биотин кРНК е синтезирана от Gene Chip 3 Express Kit (Affymetrix, Санта Клара, Калифорния, САЩ). CRNA беше фрагментирана () и хибридизирана върху Affymetrix GeneChip свински геномен масив. След стъпки за оцветяване и измиване масивите бяха сканирани (Affymetrix, Санта Клара, Калифорния, САЩ).

Анализ на данни

Анализ на пътя

Генните списъци от резултатите от микрочипове бяха представени в ръчно подбраната база данни „Анализ на изобретателността на пътищата“, за да се изяснят предполагаемите пътища, свързани с променена генна експресия в свинския черен дроб. Фокусът беше върху онези канонични пътеки, които се появиха поне веднъж в десетте най-регламентирани пътеки в рамките на един единствен анализ. Тук трябва да се отбележи, че взаимодействията, представени в мрежите, не са специфични за свински чернодробни тъкани, тъй като базата данни съдържа литература от много различни области на изследване. Уеб сървърът на име DiRE (за предсказване на отдалечени регулаторни елементи; достъп на адрес http://dire.dcode.org; [69]) беше използван за определяне на общите места за свързване на транскрипционния фактор (TFBS) на зависимите от диетата регулирани гени.

Количествена RT-PCR в реално време