Съобщено от Маклин Маккарти, Университета Рокфелер, Ню Йорк, Ню Йорк (получено за преглед на 12 януари 1999 г.)

определящ

Резюме

Туберкулозата на централната нервна система (ЦНС) е едно от най-сериозните прояви на заболяването. При децата туберкулозният менингит (ТБМ) се свързва с около 50% смъртност и повечето от оцелелите имат трайни неврологични последствия и изпитват значителни увреждания (1–4). Въпреки тежестта на клиничното представяне, клетъчните и молекулярните механизми, които са в основата на патогенезата на микобактериалната болест в ЦНС, са слабо разбрани.

По-рано докладвахме за заешки модел на експериментален TBM (5). Когато зайците бяха заразени с високи дози микобактерии в ЦНС, те се поддадоха на инфекцията в рамките на няколко дни. В този модел лечението на заразени зайци със стандартни противотуберкулозни антибиотици не предпазва животните от смърт, свързана с менингит. Въпреки това, комбинацията от противотуберкулозни лекарства с имуномодулиращото лекарство талидомид води до драстично подобрение на резултата и заразените зайци оцеляват. Благоприятният ефект на талидомид е свързан с инхибиране на производството на фактор туморна некроза α (TNF-α), намалена левкоцитоза в цереброспиналната течност (CSF) и отслабване на възпалителния отговор в менингите.

TNF-α е един от цитокините, участващи в защитния клетъчно-медииран имунен отговор на микобактериите (6). Освен защитната си роля, производството на TNF-α е свързано с развитието на патология in vivo, включително некроза на тъканите и кахексия (загуба) (7, 8). В ЦНС TNF-α участва в индуцирането на реакция на треска, активира оста хипоталамус-хипофиза-надбъбречна жлеза и задейства освобождаването на други цитокини (9-12). TNF-α може също да повлияе на транспорта на съединенията в мозъка, като „отвори“ кръвно-мозъчната бариера (BBB) ​​(10). При пациенти с бактериален менингит високите нива на TNF-α в ликвора корелират с повишени нива на IL-6 и протеини, както и ниски нива на глюкоза (13). В допълнение, нивата на TNF-α и IL-1β са свързани с продължителна треска, гърчове, спастичност и смърт (13–15).

За да проверим дали нивата на TNF-α в ликвора определят степента на патогенеза, заразихме зайци в ЦНС с различни щамове на Mycobacterium bovis, включително вирулентен M. bovis Ravenel и авирулентен M. bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG). Проследяват се постоянството на заразяващите организми, нивата на TNF-α, левкоцитозата и нивата на протеин в ликвора и се проследява клиничното протичане на инфекцията. За директна оценка на приноса на TNF-a към патогенезата, зайците са заразени с рекомбинантен щам на M. bovis BCG, който секретира миши TNF-α. Оценихме възпалителните параметри, прогресията на заболяването и мозъчната патология при тези зайци и ги сравнихме с контролните зайци, инокулирани с M. bovis BCG, носещи само плазмидния вектор.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Заразяване на организми.

Използваните щамове на M. bovis са: (i) M. bovis Ravenel (Trudeau Mycobacterial Culture Collection, TMC no.401), за които е известно, че са силно вирулентни при зайци (16, 17); (ii) M. bovis BCG Pasteur (Trudeau Mycobacterial Culture Collection, TMC № 1011), който е авирулентен при зайци; (iii) рекомбинантен щам на М. bovis BCG Монреал, генетично конструиран за секреция на миши TNF-α (BCG mTNF-α); и (iv) контролния щам на M. bovis BCG Montreal, носещ само плазмидния вектор [BCG Montreal (v)] (18). Генетичните манипулации на BCG не повлияват темповете на растеж: и двата щама [BCG mTNF-α и BCG Montreal (v)] показват подобен растеж в течност и в твърда среда. Също така двата щама показват сходни темпове на растеж в белите дробове след интравенозна инфекция на мишки B6x129 (L.-G. Bekker и G. Kaplan, непубликувани данни). Микобактериите са отглеждани в бульон Middlebrook 7H9 (Difco), последван от култура в среда Proskauer и Beck, съдържаща 0,01% Tween 80, както е описано (19). Рекомбинантните микобактерии се отглеждат както по-горе с 20 μg/ml канамицин (Sigma), както е описано (18). Микобактериите се съхраняват замразени в аликвотни части и след това се размразяват и се подлагат на кратка ултразвукова обработка, за да се разпаднат инертните материали. Крайните едноклетъчни суспензии бяха приготвени за постигане на инокулум от 5 × 10 5 или 2 × 10 7 образуващи колонии единици (cfu) на 0,1–0,2 ml.

Индукция на менингит.

Бяха използвани новозеландски бели зайци, ≈2,5 кг (развъдни лаборатории на Чарлз Ривър), както е описано (5). Анестезираните зайци бяха поставени в стереотаксична рамка, гръбначна игла беше въведена в цистерната magna за вземане на проби от CSF и интрацистернално бяха инжектирани 0,1–0,2 ml живи микобактерии или физиологичен разтвор без пироген (4–6 животни на експеримент). На 2 часа след инокулацията се получава проба от CSF, разрежда се и се поставя върху 7H10 агар, за да се определи броят на инжектираните cfu. В някои експерименти пробите от CSF бяха изтеглени на 0, 2, 4, 6 и 8 дни след инокулацията. В други експерименти пробите са получени на ден 0, 1, 3, 7, 14 и 21. След евтаназия половината мозък и сегмент на белия дроб, черния дроб и далака са събрани асептично, хомогенизирани и използвани за оценка на бациларното натоварване. Другата половина на мозъка и останалите органи бяха отстранени и фиксирани в 10% (обем/обем) буфериран формалин ацетат (Fisher) и подготвени за хистопатология. Този протокол е одобрен от Комитета по грижа и употреба на животните в университета Рокфелер.

В допълнение, рекомбинантен миши TNF-α (4 μg в 200 μl физиологичен разтвор; Endogen, Cambridge, MA) се инжектира в цистерната магна на зайци. Левкоцитозата се оценява на 0, 4, 6, 8, 10 и 24 часа, както е описано по-долу.

CSF проби.

Веднага след събирането, дублирани проби от CSF бяха анализирани за брой бели кръвни клетки (Coulter) и 100 μl CSF бяха отстранени за определяне на бактериалното натоварване. Остатъкът от CSF се центрофугира при 10 000 × g в продължение на 5 минути и супернатантата се съхранява при -70 ° C за TNF-a и протеинови анализи. Концентрацията на CSF протеин се определя чрез използване на метода на бицинхониновата киселина (BCA комплект, Pierce), както е описано от производителя. Клетъчната утайка се използва за диференциално броене на клетките (Diff-Quick, Baxter) и за електронна микроскопия.

Кръвни проби.

Кръв се събира в различни точки от ушната артерия с хепаринизирана спринцовка и се центрофугира при 10 000 × g. Плазмата се отделя и замразява при -70 ° С за оценка на TNF.

Анализ на TNF.

Тъй като понастоящем не е наличен TNF-α ELISA комплект за зайци, биологичната активност на TNF (TNF-α и TNF-β) в CSF и плазмата е изследвана чрез използване на миши фибробласти L929 като целеви клетки в анализ за цитотоксичност, както е описано (20). Минималното ниво на откриване е 16 единици/ml.

Определяне на нива на миши TNF-α.

Способността на рекомбинантните микобактерии да секретират миши TNF-a беше проверена чрез измерване на концентрацията на цитокин в супернатантите на бактериалната култура чрез ELISA (Endogen, Cambridge, MA). Нивата на миши TNF-a в заешки проби от CSF също се определят чрез ELISA.

cfu Анализ.

Бактериалните натоварвания в ликвора, мозъка, белите дробове, черния дроб и далака на заразените зайци се оценяват чрез нанасяне на 10-кратни серийни разреждания на ликвора и на хомогенатите на органи върху плочи от агар Middlebrook 7H10 (Difco), както и върху агар Middlebrook 7H10 допълнено с 20 μg/ml канамицин (Sigma). Плаките се инкубират при 37 ° С в продължение на 2-3 седмици. Колониите бяха преброени и изразени като cfu.

Хистопатология.

След фиксиране в 10% формалин (Fisher), пробите от органи се вграждат в парафин (TissuePrep 2, Fisher) и след това се разделят и оцветяват с хематоксилин и еозин и киселинно бързо оцветяване (Kinyouns). Мозъците бяха разрязани напречно на последователни 2 до 3-милиметрови участъци от рострален до каудален. Избрани са секции, представящи предния, средния и задния мозък.

Електронна микроскопия.

Клетъчната утайка на CSF и част от мозъка, включително менингите, са обработени за трансмисионна електронна микроскопия, както е описано (21). Секции бяха оцветени и изследвани с пропускателен електронен микроскоп JEM 100CX (JEOL).

Статистически анализ.

Резултатите са представени като средни стойности, получени за всички животни, оценени във всеки момент от времето. Данните бяха анализирани с помощта на независим тест на Student's t за сравняване на различните групи животни. P 5 cfu) или висока (2 × 10 7 cfu) доза предизвикват относително високи дозозависими нива на TNF в CSF, които достигат своя връх 2 часа след инфекцията (фиг. 1). Значителни нива са наблюдавани до ден 8 (данните не са показани). TNF също се открива системно в плазмата на зайци, заразени с високата доза Ravenel (данните не са показани). За разлика от това, зайци, инокулирани с BCG Pasteur, са имали по-ниски нива на TNF в ликвора на 2 h и едва забележими нива в по-късни моменти след постинфекция (фиг. 1). По всяко време не се открива TNF в плазмата на тези зайци. Зайци, заразени с BCG Montreal (v), са имали по-ниски нива (висока доза) или никакъв TNF в ликвора (ниска доза) дори при пик (2 часа). По този начин Ravenel индуцира повече TNF, отколкото щамовете BCG, които индуцират или по-ниски нива, или никакви.

Нива на TNF в CSF 2 часа след инфекцията. Зайците бяха инокулирани интрацистернално с висока (2 × 10 7 cfu) (сенчести ленти) или ниска (5 × 10 5 cfu) (кръстосани щрихи) доза микобактерии. Значително по-ниски нива на TNF се наблюдават при зайци, заразени с ниската доза на M. bovis BCG Montreal (v) в сравнение с M. bovis Ravenel (P = 0,02). Стойностите са средни стойности ± SEM на резултатите, получени от 4–6 зайци на група. * Означава статистическа значимост.

Значителни разлики също са наблюдавани в отговора на левкоцитите в CSF (фиг. 2). Ravenel индуцира високо натрупване на левкоцити, което постепенно се увеличава, което показва, че BBB е нарушен. На 6-ия ден броят на клетките достига> 11 000 клетки на mm 3 и> 15 000 клетки на mm 3 при зайци, заразени съответно с ниска доза и висока доза. За разлика от него, BCG Pasteur и Montreal (v) не успяват да предизвикат забележителна левкоцитоза по всяко време (фиг. 2). При всички зайци, изследването на диференциалния брой в ликвора разкри, че> 90% от клетките са мононуклеарни (моноцити и лимфоцити).

Брой на левкоцитите и cfu в CSF на заразени зайци. Зайците се инокулират интрацистернално с висока (попълнени символи) или ниска (отворени символи) доза или от M. bovis Ravenel, BCG Pasteur, или BCG Montreal (v). Левкоцитозата е намалена при зайци, заразени с BCG Pasteur и BCG Montreal (v) в сравнение с Ravenel на ден 4 (P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Микобактериални нива в органи на заразени зайци (ден 8)

Менингит след инфекция с различни щамове на M. bovis.

Възпалителните параметри и бактериалното натоварване корелират с клиничния ход на менингита. Зайци, заразени с високи дози Ravenel, развиват остър прогресиращ менингит с тежки неврологични признаци, включително сънливост или раздразнителност, загуба на координация, хемипареза или хемиплегия и оцеляват 4-8 дни. Ниските дози Ravenel предизвикват субакутен възпалителен отговор, което води до забавено начало, по-малко тежки симптоми и оцеляване от поне 8 дни. Животните, инокулирани с BCG Pasteur или Montreal (v), не развиват никакви симптоми и не показват клинични признаци на заболяване на ЦНС.

Отговор на зайци след инфекция на ЦНС с рекомбинантен BCG секретиращ миши TNF-α.

Резултатите, описани по-горе, предполагат, че пиковите нива на TNF-α при 2 h постинокулация определят патогенезата и хода на микобактериалната ЦНС инфекция. За да се обърнем директно към ролята на TNF-α, заразихме зайци с ниска доза (5 × 10 5 cfu) от рекомбинантен щам на BCG Montreal, който експресира мишия ген за TNF-α (BCG mTNF-α) или контролния щам BCG Монреал (v). Животните се наблюдават в продължение на 3 седмици.

За да се потвърди, че BCG mTNF-α секретират миши цитокин по време на инфекцията, микобактериалните колонии, възстановени от ликвора, се отглеждат в бульон 7H9, допълнен с 20 μg/ml канамицин в продължение на 5 дни, и супернатантите се тестват за TNF-α с помощта на ELISA. Концентрациите на TNF-α бяха в диапазона от 10 000–40 000 pg/ml през всички времеви точки, което показва, че рекомбинантният BCG произвежда миши TNF-α през целия експеримент.

Отговор на зайци, заразени с BCG mTNF-α. Зайците бяха заразени интрацистернално с 5 × 10 5 cfu BCG mTNF-α (попълнени символи) (n = 10) или BCG Montreal (v) (отворени символи) (n = 9) и наблюдавани в продължение на 21 дни. (Горна лява) Концентрация на TNF в CSF на заразени зайци. Нивата на TNF за 2 часа са по-високи при зайци, инокулирани с BCG mTNF-α в сравнение с BCG Montreal (v) (P 3), се наблюдава в CSF 24 часа след приложението на цитокини. Този резултат е подобен на резултатите, получени в предишно проучване върху ефектите на екзогенно прилаган заешки TNF-α (11). Нашата констатация показва, че зайците реагират на миши TNF-α.

След това изследвахме отговора на левкоцитите в ликвора. BCG Montreal (v) не предизвиква значителна левкоцитоза (Фиг. 3). Броят на клетките беше 3 през целия експеримент. За разлика от това, BCG mTNF-α индуцира обширен приток на левкоцити в ликвора. Високият брой на левкоцитите се запазва до 21 ден.

Друга характеристика, характерна за нараняването на BBB, е натрупването на протеин в ликвора. Зайците, инокулирани с BCG Montreal (v), са имали нива на CSF протеин в нормалните граници (Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

CFU в органи на заразени зайци (ден 21)

Хистопатология на мозъчните обвивки и мозъка на заразени зайци (21 дни). (А) Заек, заразен с BCG Монреал (v). Лек фокален възпалителен отговор се наблюдава в мозъчните обвивки (стрелки). Няма данни за увреждане на периваскуларната тъкан или левкоцитна инфилтрация в невропила. (B) Заек, заразен с BCG mTNF-α. Наблюдава се подчертано удебеляване на лептоменингите и разтягане на арахноидното пространство от голям брой възпалителни клетки (стрелки). Обърнете внимание на разширяване на периваскуларното възпаление до невропил. Секциите се оцветяват с хематоксилин и еозин. Увеличение × 25. Кръвоносните съдове са етикетирани V.

Електронни микрографии на клетъчната утайка на CSF (ден 14) (A и B) и менингите (ден 21) (C и D) на зайци, заразени с BCG mTNF-α (A и C) или контролират BCG Montreal (v) (B и D). (А) Клетъчна утайка от ликвора на заек, заразен с BCG mTNF-α. Наблюдават се едноядрени клетки, включително увеличени неправилни макрофаги (М) и лимфоцити (Ly). Обърнете внимание на микобактериите в плътна вакуола (стрелки) в цитоплазмата на паразитиран макрофаг. Увеличение × 3 600. (а) По-голямо увеличение на вакуолата, съдържаща микобактерии. Увеличаване × 20 000. (B) Клетъчна утайка от ликвора на заек, заразен с BCG Montreal (v). Наблюдават се кръгли лимфоцити (Ly) и моноцити (M). В тези клетки не са открити фагоцитирани микобактерии. Увеличение × 2900. (В) Менингите на заек, заразен с BCG mTNF-α. Показана е част от менингеалната област, съдържаща капилярен съд (V), с лимфоцити (Ly) и моноцити (M) в периваскуларното пространство. Обърнете внимание на мигриращ лимфоцит, пресичащ ендотелния монослой в горната част на микрографията. Увеличение × 2900. (D) Менингите на заек, заразен с BCG Montreal (v). Показан е менингеален съд (V). В периваскуларното пространство се наблюдават малко мигриращи макрофаги (М). Увеличение × 2200.

ДИСКУСИЯ

Експериментите, описани тук, показват, че TNF-a е определящ фактор за микобактериалната патогенност в ЦНС. Няколко доказателствени реда подкрепят това заключение. Когато зайците са заразени с микобактериален щам, който предизвиква високи нива на TNF-α в ликвора, те развиват тежък остър менингит и умират в рамките на няколко дни. Това не се наблюдава, когато зайците са заразени с щамове на микобактерии, които не предизвикват много освобождаване на TNF-α. Освен това по-рано показахме, че при заразените зайци инхибирането на производството на TNF-α чрез лечение с талидомид блокира развитието на менингит (5). И накрая, когато невирулентният щам е генетично конструиран, за да съдържа функционален ген за TNF-α, невирулентният щам става вирулентен. Тези резултати предполагат, че патогенността на микобактериите в ЦНС зависи поне отчасти от индукцията на TNF-a, което води до нарушаване на BBB и отключване на възпалителната каскада. Тези промени водят до мозъчен оток, цереброваскуларни промени и повишено вътречерепно налягане (22).

Производството на TNF-α в ЦНС може да бъде толкова вредно, защото засяга съдовия ендотел чрез индуциране на прокоагулантна активност (23), образуване на тромби и производство на азотен оксид синтаза (24-26), като по този начин причинява ендартериит. Запушването на големи или малки съдове са най-честата причина за парализа на черепните нерви, хемипареза и парализа. Освен това се съобщава, че инжектирането на рекомбинантен човешки TNF-α в цистерната magna на зайци води до остро намаляване на церебралното усвояване на кислород и продължително намаляване на мозъчния кръвен поток (24). Дори малки количества TNF-α могат да окажат вредно въздействие върху капилярите, които вече са сенсибилизирани от микобактериални продукти (27). Нашите морфологични проучвания върху мозъка и мозъчните обвивки на зайци, заразени с BCG mTNF-α, демонстрират директно увреждането на съдовата система от локалното производство на TNF-α (Фиг. 5 и 6).

Възможно е ефектите на TNF-α върху микобактериалните числа в заразената клетка да се медиират чрез регулиране на апоптозата. Наскоро съобщихме, че индуцирането на апоптоза на заразени с микобактерии макрофаги с ATP 4 - или H2O2 е свързано с убиване на вътреклетъчните бацили (21, 30). Понастоящем изследваме дали нивата на TNF-α определят степента на апоптоза на заразени с микобактерии човешки моноцити in vitro, както и дали модулираната с цитокини апоптоза е свързана с убиване на вътреклетъчни бацили в модела на заешката инфекция.

Благодарности

Благодарим на Вилхелмин Хелман за нейната експертна помощ при изследванията на електронната микроскопия, Джуди Адамс за подготовката на фигурите и Маргарит Нулти за секретарската помощ. Тази работа беше подкрепена отчасти от Celgene Corporation (Warren, NJ).