Редактирано от Антъни Керами, The Kenneth S. Warren Laboratories, Tarrytown, NY, и одобрено на 16 април 1999 г. (получено за преглед на 11 февруари 1999 г.)

ключов

Резюме

Затлъстяването бързо се увеличава в западните общества и заедно с това съществува постоянно нарастващ риск от свързани със затлъстяването разстройства (синдром X; справки 1 и 2), включително сърдечно-съдови заболявания (3, 4). Въпреки мащаба и цената на този проблем, молекулните промени в затлъстяването, които насърчават тези условия, все още предстои да бъдат дефинирани. Туморният фактор на некроза α (TNF-α) е хронично повишен в мастните тъкани на затлъстели гризачи и хора (5-8) и може да представлява важна връзка между затлъстяването и инсулиновата резистентност (5, 9, 10). Все още не е ясно дали този цитокин също допринася за други патологии, свързани със затлъстяването. Експерименталната подкрепа за тази възможност би помогнала да се изясни ролята на TNF-α при различните метаболитни и сърдечно-съдови нарушения, свързани със затлъстяването.

Повишената честота на сърдечно-съдови заболявания (3, 4) може да бъде свързана с повишените нива на хемостатични фактори като фибриноген, фактор VII и инхибитор на плазминогенов активатор 1 (PAI-1), наблюдавани в плазмата на пациенти със затлъстяване (11–14). PAI-1 е основният инхибитор на активацията на плазминоген in vivo, а повишената PAI-1 в плазмата компрометира нормалните механизми на клирънсов клирънс и насърчава тромбозата (15, 16), включително инфаркт на миокарда (16, 17). Въпреки че PAI-1 е драстично регулиран при човешкото затлъстяване (11–14), малко се знае за произхода на този плазмен инхибитор при затлъстяването или за сигналите, които контролират неговата биосинтеза. Последните данни сочат, че самата мастна тъкан може да допринесе за повишената експресия на PAI-1 при затлъстяване. Например, относително високи нива на PAI-1 иРНК са открити в миша мастна тъкан (18), а клиничните проучвания на пациенти със затлъстяване показват, че плазмените нива на PAI-1 намаляват след загуба на тегло поради операция или диетична намеса (2, 3, 19 –21). Освен това при генетично затлъстели (ob/ob) мишки експресията на адипоцитен PAI-1 и плазмените PAI-1 са значително повишени (22). Значителна експресия на PAI-1 иРНК също е демонстрирана в култивирани 3T3-L1 адипоцити (23), висцералните и s.c. мазнини от затлъстели плъхове (24) и мастни тъкани от хора (25).

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Животни.

Възрастни мъжки затлъстели мишки (C57BL/6J ob/ob) и техните слаби аналози (C57BL/6J + /?) Са получени от лабораторията The Jackson. ob/ob мишки с дефицит и на двата TNFR (p55 -/- p75 -/-) са генерирани чрез кръстосване и обратно кръстосване на постни мишки с дефицит в тези рецептори към ob/ob мишки, както е описано (28), и генотипирани чрез използване на PCR-базирани анализи (28). В някои експерименти на затлъстели мишки се инжектира i.p. или с 25 μg от IgG фракцията на неутрализиращ mAb хамстер към TNFα на мишка (Genzyme), или с еквивалентни количества нормален IgG хамстер като контрола. Шест часа по-късно мишките се анестезират чрез вдишване на метафан (Pitman – Moore, Mundelein, IL), кръвта им се събира в 20 mM (крайна концентрация) EDTA, рН 8,0 и мастните им тъкани се отстраняват бързо и веднага се замразяват в течност азот за получаване на обща РНК (23). В други експерименти, диви тихи сухи мишки (C57BL/6J), както и слаби мишки без p55 TNFR, p75 TNFR или и двете, се инжектират i.p. с рекомбинантен миши TNF-α, 4 μg на мишка в 100 μl стерилен физиологичен разтвор (любезен подарък от Richard Ulevitch, The Scripps Research Institute). На контролните животни се инжектира само 100 μl физиологичен разтвор. Три часа по-късно се събира кръв и мастните тъкани се отстраняват и обработват за in situ хибридизация (по-долу) или за получаване на обща РНК.

Определяне на нивата на PAI-1, инсулин и TGF-β в плазмата.

Активният PAI-1 антиген в плазмата се определя чрез използване на t-PA анализ на свързване, както е описано (29). Резултатите бяха сравнени със стандартна крива, конструирана с използване на рекомбинантна мишка PAI-1. Плазмените нива на инсулин се определят чрез използване на ELISA анализ на инсулин от плъх от Crystal Chem (Чикаго) заедно със стандарт за инсулин на мишки, съгласно инструкциите на производителя. Общите плазмени нива на TGF-β бяха измерени с помощта на комплекта PREDICTA TGF-β1 от Genzyme, съгласно инструкциите на производителя.

РНК анализ.

Концентрацията на мРНК на PAI-1 и TGF-β в тъканите се определя чрез количествена обратна транскрипция – PCR, като се използва конкурентна cRNA, съдържаща праймери нагоре и надолу по веригата за PAI-1, TGF-β и β-актин (вътрешен контрол), както е описано (22, 23). След обратна транскрипция и PCR амплификация в присъствието на 32 P крайно белязани 5 'праймери, PCR продуктите се електрофорезират върху 1,8% агарозни гелове. Подходящите ленти, съответстващи на вътрешния стандартен cRNA продукт и целевия mRNA продукт, се изрязват от гела и вградената радиоактивност се определя количествено чрез използване на сцинтилационен брояч. Изградена е стандартна крива за cRNA за вътрешен контрол, която се използва за определяне на специфичната активност на целевата mRNA, както е описано (22, 23, 27). Вариациите в натоварването на пробата бяха оценени чрез директно сравнение с β-актин иРНК. In situ хибридизация върху вградени в парафин тъканни участъци (3-5 μ) се извършва, както е описано, като се използват 35 S-маркирани антисенс или сензорни рибопроби (30). Слайдовете бяха изложени на тъмно при 4 ° C в продължение на 4-8 седмици. След разработването на предметните стъкла те бяха оцветени с хематоксилин и еозин.

Статистически анализ.

Статистическо сравнение на резултатите беше извършено с помощта на несдвоения тест на Student’s t.

РЕЗУЛТАТИ

Промени в експресията на PAI-1 при ob/ob мишки след инжектиране на неутрализиращо антитяло към мишка TNF-α.

Промени в експресията на PAI-1 при ob/ob мишки след инжектиране на неутрализиращо антитяло към TNF-α. Затлъстели (ob/ob) мъжки мишки (по четири на възраст 14 седмици) са инжектирани i.p. с контролен хамстер IgG (черни ленти) или с неутрализиращ хамстер mAb срещу миши TNF-α (сиви ленти). Шест часа по-късно плазмата (А) или мастната тъкан (В) се събират и анализират за PAI-1 антиген (А) или иРНК (В), както е описано в Материали и методи. Показано е и нивото на PAI-1 антиген в плазмата (A) или PAI-1 иРНК (B) при съпоставени с възрастта слаби мишки (n = 4) (празни стълбове). Лентите за грешки представляват средна стойност ± SD.

Ефект от делецията на TNFR върху експресията на PAI-1 при ob/ob мишки.

Ефект на делеция на двата TNFR върху експресията на PAI-1 при ob/ob мишки. Плазма и мастна тъкан се събират от 20 до 24-седмични мъжки и женски ob/ob мишки и ob/ob мишки без два TNFR (p55 -/-, p75 -/-). Плазменият PAI-1 антиген (А) или мастната тъкан PAI-1 иРНК (В) бяха анализирани, както е описано в Материали и методи. (A) n = 6 за всяка група; стълбовете представляват средна стойност ± SD. Сравнение на ob/ob срещу ob/ob p55 -/-, p75 -/-: P -/-, p75 -/-: P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Мишките, които нямат и двата TNFR, имат намалени нива на плазмен инсулинов антиген и TGF-β иРНК на мастната тъкан

Ефект от екзогенно лечение с TNF-α върху експресията на PAI-1 при див тип и дефицитни мишки с дефицит на TNFR.

Ефект на екзогенния TNF-α върху експресията на PAI-1 при слаби мишки от див тип и дефицит на TNFR. Слаби мишки или дефицитни мишки с дефицит на TNFR (по четири на възраст 20–24 седмици) се инжектират i.p. с 4 μg миши рекомбинантен TNF-α (отворени ленти) или физиологичен разтвор (напълнени пръти). Три часа по-късно плазмата (А) или мастната тъкан (В) се събират и анализират за PAI-1 антиген (А) или иРНК (В), както е описано в Материали и методи. Лентите за грешки представляват средна стойност ± SD.

Ефект на TNF-α върху клетъчната локализация на PAI-1 иРНК при мишки от див тип и TNFR с дефицит. In situ хибридизация е извършена върху парафинови срезове на мастните тъкани от див тип необработени мишки (A) и третирани с TNF-α див тип (B), p55, p75 TNF-дефицитни (C), p55 TNFR-дефицитни (D) и p75 мишки с дефицит на TNFR (E). Слайдовете бяха изложени в продължение на 4 седмици при 4 ° С и след това оцветени с хематоксилин и еозин. а, адипоцити. Стрелките показват положителни сигнали за PAI-1 иРНК в мазнините (B, D и E). Увеличение: × 400 за всички секции.

Ефект от екзогенно лечение с TNF-α върху експресията на TGF-β при слаби мишки от див тип и дефицит на TNFR.

Ефект от екзогенното лечение с TNF-α върху експресията на TGF-β иРНК при чисти мишки от див тип и постни дефицити на TNFR. Мишки от див тип или мишки с дефицит на TNFR (на възраст 20–24 седмици) се инжектират i.p. с 4 μg миши рекомбинантен TNF-α (отворени стълбове) или физиологичен разтвор (напълнени барове). Три часа по-късно мастните тъкани бяха събрани и анализирани за нивата на TGF-β иРНК, както е описано в Материали и методи. n = 3, грешките представляват ± SD.

Тези резултати също са потвърдени чрез анализ на хибридизация in situ (Фиг. 6). Слаб, но последователен сигнал за TGF-β иРНК е открит в множество клетъчни типове в мазнината от нетретирани мишки (фиг. 6 А и В). Този сигнал се увеличава след третиране с TNF-a на мишки от див тип (фиг. 6С) и мишки, които нямат само p75 TNFR (фиг. 6F). Въпреки това, сигналът за TGF-β иРНК не се увеличава след третиране на мишки, които нямат както TNFR (фиг. 6D), така и p55 TNFR (фиг. 6Е).

Ефект на TNF-α върху клетъчната локализация на TGF-β иРНК при мишки от див тип и TNFR с дефицит. In situ хибридизация беше извършена върху парафинови срези на мастните тъкани от нетретирани мишки от див тип (A и B) и третирани с TNF-α див тип (C), p55, p75 TNFR-дефицитни (D), p55 TNFR-дефицитни ( E) и p75 TNFR-дефицитни (E) мишки. Слайдовете бяха изложени в продължение на 8 седмици при 4 ° C и оцветени с хематоксилин и еозин. а, адипоцити. Стрелките показват положителни сигнали за TGF-β иРНК в мазнината. Увеличение: × 400 за всички секции.

Въпреки резултатите, показани на фиг. 5 и 6, не успяхме да демонстрираме значително увеличение на плазмения TGF-β в отговор на TNF-α (не е показано). По този начин, повишеното ниво на TGF-β иРНК в мастната тъкан не се отразява като повишен TGF-β антиген в плазмата, което предполага, че са включени или допълнителни посттранскрипционни механизми, или че TGF-β в мазнината може да играе по-локална автокринна или паракринна функция.

ДИСКУСИЯ

TNF-α и сърдечно-съдови заболявания при затлъстяване. TNF-α е хронично повишен в мастната тъкан при затлъстяване и допринася за инсулиновата резистентност/хиперинсулинемия и повишения TGF-β, свързани с това състояние. TNF-α, инсулинът и TGF-β от своя страна могат да доведат до повишен PAI-1, тъканния фактор и евентуално други хемостатични гени, които могат да повишат сърдечно-съдовия риск.

Благодарности

Благодарим на д-р J. Peschon (Immunex Research and Development Corp.) за мишките с дефицит на TNFR. Също така благодарим на T. Thinnes за техническа помощ, Laurence Hervio за помощта с графиката и M. McRae за нейните експертни секретарски умения. Тази работа беше подкрепена отчасти от безвъзмездни средства от Националните здравни институти (HL 47819) и Novartis за D.J.L. и отчасти от грант DK 52539-01A1 от Националните здравни институти на G.S.H. Това е ръкопис № 11248-VB на Scripps Research Institute.

Бележки под линия

↵ ‡ До кого трябва да бъдат адресирани заявките за повторно отпечатване. e-mail: loskutofscripps.edu .

Този документ беше изпратен директно (Track II) в Proceedings Office.