Резюме

Въведение

Ракът на панкреаса е една от водещите причини за смъртност от рак и остава един от най-смъртоносните солидни човешки злокачествени заболявания в света [1]. Пациентите с рак на панкреаса обикновено се диагностицират в нерезектабилен стадий и в повечето случаи пациентите с напреднал рак на панкреаса имат лош отговор на химиотерапия или лъчетерапия. Въпреки факта, че терапевтичните методи са подобрени, прогнозата за пациентите с рак на панкреаса все още остава лоша с ниска петгодишна преживяемост [2]. Следователно е необходимо продължаване на изследванията на нови агенти или алтернативни терапевтични стратегии за лечение на рак на панкреаса, като по този начин се подобрява качеството на живот на пациентите.

термична

В тази статия ние изследвахме ефектите на EGCG или CGA, комбинирани с TC-HT, върху инхибирането на растежа на PANC-1 клетките и оценихме регулацията на клетъчния цикъл, апоптозата и експресията на асоциираните протеини, за да изясним основните им механизми. Нашите резултати показват, че едновременното приложение с TC-HT и EGCG или CGA значително инхибира клетъчната пролиферация и увеличава клетъчната смърт чрез индуциране на спиране на клетъчния цикъл и митохондриален апоптотичен път. Тези открития първо показват, че EGCG и CGA могат да бъдат ефективни синергизатори на топлина и че максималните синергични ефекти върху клетките PANC-1 могат да бъдат получени, когато се прилага TC-HT. Освен това TC-HT като термична обработка може да бъде много по-нежен и осъществим, главно поради мнението, че самият TC-HT е относително безвреден за клетките. Ние вярваме, че това проучване предоставя интересната концепция за циклично термично приложение при лечение на рак in vitro и подчертава потенциала на TC-HT като алтернативно термично лечение.

Материали и методи

Клетъчна култура

Клетъчна линия на рак на панкреаса на човека PANC-1 е получена от Центъра за събиране и изследване на биоресурси на Института за изследвания и развитие на хранителната индустрия (Синчу, Тайван). Клетките се посяват в 75 cm 3 колби за клетъчни култури и се отглеждат в модифицирана среда на Dulbecco на Eagle's (DMEM) (Hyclone), допълнена с 10% фетален говежди серум (FBS) (Hyclone) и 1% пеницилин-стрептомицин (Gibco) в овлажнен 5% CO2 инкубатор при 37 ° C.

Медикаментозно лечение и излагане на TC-HT

(A) (B) Схема на настройка на експеримента и настройка на програмите TC-HT. (C) Действителната температура, регистрирана на всеки 20 секунди в клетките PANC-1 през целия период на експозиция.

MTT анализ

Клетъчната жизнеспособност беше достъпна чрез анализ на 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолиев бромид (MTT) (Sigma). Клетките се посяват в 24-ямкови плаки и се инкубират една нощ при 37 ° С. След едноагентно третиране или комбинирано третиране на TC-HT с 0,05% DMSO (контрол на носителя), EGCG или CGA за 24 часа, средата се отстранява и клетките се промиват с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS). След това клетките се инкубират в DMEM, съдържащ 0,5 mg/ml МТТ за допълнителни 4 часа при 37 ° С. След това средата се отстранява и се добавя DMSO за разтваряне на кристалите на формазан. Супернатантата от всяка проба се прехвърля в 96-ямкови плаки и абсорбцията се отчита при 570 nm, като се използва ELISA четец за микроплаки. Изчисляването на коефициента на синергизъм (SQ) разделя комбинирания ефект на сумата □ от отделните ефекти. Даденото лечение показва синергия, когато SQ е по-голям от 1,0.

Клоногенен тест за оцеляване

Клетките PANC-1 се посяват при 1000 клетки/съд в 35 mm петриеви чашки за 24 часа и се третират с 0,05% DMSO (контрол на носителя), CGA, EGCG и TC-HT самостоятелно или в комбинация. След обработката клетъчната среда беше заменена и съдовете бяха култивирани в овлажнен 5% CO2 инкубатор при 37 ° С за допълнителни 14 дни. Най-накрая клетките бяха фиксирани с 4% параформалдехид (PFA) (Sigma) за 10 минути и оцветени с 0.1% кристално виолетово (Sigma). Броят на колониите, съдържащи повече от 50 клетки, и броят на колониите във всяка третирана група се нормализира до контролната група.

Анализ на клетъчния цикъл

Клетките се засяват в 35 mm чашки на Петри и се инкубират една нощ при 37 ° С. След 24 h обработка с DMSO (контрол на носителя), CGA, EGCG и TC-HT самостоятелно или в комбинация, клетките се събират, измиват се с PBS и се фиксират със 70% етанол при 4 ° С за 30 минути. След това клетките се оцветяват с пропидиев йодид (PI) (BD Bioscience) и RNase A (Thermal Scientific) за 30 минути на тъмно. Оцветените клетки бяха подложени на анализ на клетъчния цикъл с помощта на проточен цитометър (FACSCanto II; BD Biosciences) и данните бяха анализирани със софтуера ModFit LT.

DAPI анализ за оцветяване

DAPI оцветяването се използва за откриване на морфологични характеристики на ядрото. Клетките се култивират върху стъклени капаци в 35-милиметрови чаши на Петри. В края на всяко 24-часово третиране клетките се промиват два пъти с PBS и се фиксират с 4% PFA за 10 минути при стайна температура. След измиване два пъти с PBS, стъклените капаци с прикрепени клетки бяха монтирани с помощта на Fluoroshield монтажна среда с DAPI (Abcam) и изследвани с флуоресцентен микроскоп (Axio Imager A1; ZEISS).

Анализ на двойно оцветяване на анексин-V/PI

Апоптозата се определя чрез използване на анексин V-FITC/PI комплект за откриване на апоптоза (BD Biosciences). Накратко, клетките PANC-1 бяха третирани с TC-HT, комбинирани с DMSO (контрол на носителя), CGA или EGCG, и след това клетките бяха събрани с трипсин-EDTA (Gibco) и събрани чрез центрофугиране при 2000 × g за 5 минути, промива се два пъти със студен PBS и се суспендира отново в свързващ буфер, съдържащ анексин V-FITC и PI. Клетъчните суспензии се инкубират в продължение на 15 минути при стайна температура на тъмно и се анализират с FACS Calibur поточен цитометър.

Измерване на потенциала на мембранната митохондрия (MMP)

Клетките, третирани с 0,05% DMSO (контрол на носителя), CGA, EGCG и TC-HT в продължение на 24 часа самостоятелно или в комбинация се събират и ресуспендират с PBS, последвано от оцветяване с 20 nM DiOC6 (3) (Enzo Life Sciences International Inc.) за 30 минути при 37 ° C на тъмно. След това фракцията от клетки, показващи нисък MMP, се измерва с проточен цитометър.

ROS откриване

Нивата на клетъчно реактивни кислородни видове (ROS) на супероксиден анион (O2 • -) бяха открити с помощта на флуоресцентното багрило дихидроетидий (DHE) (Sigma). Клетките се третират с посочените обработки, измиват се с PBS и след това се инкубират с 5 цМ DHE в продължение на 30 минути при 37 ° С на тъмно. Интензивността на флуоресценцията се измерва чрез поточна цитометрия и нивата на ROS се изразяват като средна интензивност на флуоресценция (MFI).

Western blot анализ

Статистически анализ

Резултатите бяха представени като средно ± стандартно отклонение (SD). Статистически анализ, използващ еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), извършен със софтуера SigmaPlot. Резултатите се считат за статистически значими, когато р-стойностите са по-малки от 0,05. Всеки експеримент е направен в три екземпляра.

Резултати

TC-HT в комбинация с полифеноли синергично инхибира пролиферацията на PANC-1 клетки